(Phương pháp quang phổ kế)
1. Nguyên tắc
Đo mật độ quang học của mẫu nghiệm sau khi đã chuyển huyết sắc tố thành
methemoglobin - một dẫn xuất bển vững mà sự hấp phụ tốt nhất ở bước sóng B40nm. Do mật độ quang tỷ lệ thuận với nẵng độ của huyết sắc tố nên đễ dàng tính ra được lượng huyết sắc tố của mẫu nghiệm.
2. Máu xét nghiệm, thuốc thử và dụng cụ
.= Máu tinh mạch hoặc mao mạch chưa kịp đông hay đã được chống đông bang EDTA khé 1,5mg/ml.
— Dụng cụ lấy máu mao mach (dau ngón tay) và tĩnh mạch.
— Dung địch drabkin sử dụng.
—_ Hemo-trol chuẩn.
— Pipette vach 20 pl (0,02 ml).
— Quang phổ kế có bước sóng 540 nm.
3. Kỹ thuật
` 3.1. Thiết lập biểu đồ mẫu
Làm bằng dung dịch chuẩn mà hiệu giá cyanmethemoglobin (bền vững trong điều kiện bảo quản ở 4°C) đã được xác định chính xác và ghi rõ trên mỗi lọ mẫu chuẩn, thường khoảng 60 mg/100 ml, nghĩa là mật độ quang học tương ứng với một mẫu máu chứa lượng huyết sắc tố 1ð mg/100 mÌ khi được pha loãng trong dung địch drabkin (205ml). Để vẽ đường thẳng mẫu, người ta thực biện trên một loạt ống nghiệm tương ứng với hiệu giá của hemo-trol đã ghi chú:
Bảng 1.1: Tương quan giữa hiệu giá hemo-trol va mat do quang (OD)
Số ống nghiệm 1 2 3 4 5 Chứng
Drabkin sử dụng 0ml +ml 2ml 3ml 4ml 5ml
Heme-trol 5ml 4ml 3ml 2ml tml 0ml
Mật độ quang OD, OD, OD; OD, OD, OD,
Huyét sc té (g/l) 5n/20 4n/20 3n/20 2n/20 1n/20 0
Đo mật độ quang học các ống nghiệm ở bước sóng 540nm, ghi trên giấy kẻ ô vuông milimet các mật độ quang học đọc được (OD,, OD;,..., OD¿) lên trục tung và lượng huyết sắc tố tương ứng tớnh được lờn trục hoành (đơn vị ứủ).
Cách tính lượng huyết sắc tố tương ứng từ mật độ quang đo được như sau:
Ví dụ, nếu tỷ lệ huyết sắc tố của hemo-trol chuẩn là 58 mg/100m] = 580g/1, thì:
Ống 1= 580 x5: 20 = 145g/1.
Ống ð= 580 x 1: 20 = 29g71.
Ống chứng = 0.
Nhờ có biểu để mẫu được thiết lập (một đường thẳng), đọc huyết sắc tố sẽ đơn giản bằng cách ghỉ mật độ quang học ở trục tung và suy ra lượng huyết sắc tố ở trục hoành tương ứng.
Trong điều kiện khó khăn, không thiết lập được biểu đổ mẫu hoặc vi môi trường phòng xét nghiệm không đảm bảo (không đủ kín, không có điểu hoà, không có hút ẩm) nên đo các mẫu nghiệm cùng với một mẫu hemo-trol chuẩn sau đó tính ra lượng huyết sắc tố cho mẫu nghiệm.
3.2. Ðo mẫu xét nghiệm
Chuẩn bị những ống nghiệm đựng 5ml dung dịch drabkin sử dụng. Cho vào mỗi ống 0,09 mì máu chưa kịp đông hoặc đã được chống đông khô, lắc thật đều, để khoảng 5 phút cho tan hoàn toàn hểng cầu. Đổ vào cóng của quang kế dung dịch drabkin sử dụng, điều chỉnh mật độ quang ở bước sóng 540 nm về số 0 (trừ
trắng). Đổ dung dịch cần đo vào cóng, đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm.
Sau đó đối chiếu với biểu để mẫu hoặc dung dịch chuẩn (hemo-trol) để có tỷ lệ huyết sắc tố g1.
4. Nguyên nhân sai số thường gặp
-_ Độ pha loãng không chuẩn: hút máu hoặc dung dịch drabkin không đúng số lượng quy định.
- _Héng cầu chưa tan hết trong dung dịch drabkin: lắc không đều, thời gian
quá ngắn.
— Huyết tương duc.
— Bạch cầu quá cao.
—_ Điện nguồn không ổn định hoặc quá thấp.
— Kính lọc mờỡ do hơi nước hoặc cũ.
— Dụng dịch drabkin sử đụng không đúng nồng độ hoặc bị hồng.
5. Các phương pháp khác
5.1. Phương pháp máy đếm tế bào: Nguyên tắc đo huyết sắc tố của máy đếm tế bào cũng giống như phương pháp đo bằng quang phổ kế nói trên. Tuy nhiên, phương pháp máy đếm tế bào (kể cả máy tự động và máy bán tự động) tiện lợi
và chính xác hơn nhiều. Xét nghiệm viên không cần chuẩn bị dung dịch chuẩn,
không cần thiết lập biểu đổ mẫu, không cần pha loãng máu trong dung dịch drabkin.
5.2. Phương pháp đo trực tiếp bằng máu toàn phần: Dựa trên sự chênh lệch
cường độ ánh sáng phản xạ khi chiếu vào giọt máu toàn phần so với chuẩn trắng
của máy đo. Phương pháp này gọn nhẹ về trang thiết bị, đơn giản về kỹ thuật, thích hợp cho công tác thực địa nhất là các vùng xa, vùng sâu; nhưng kết quả kém ổn định so với phương pháp quang phổ kế.
5.3. Phương pháp so màu bằng mắt trên huyết sắc kế Sahli: Phương pháp này
kém chính xác. Hiện nay không nên áp dụng.
a? os ki, h3
DO THE TiCH KHOI HONG CAU
(Phuong phap microhematocrit)
4. Nguyén tac
Thể tích khối hồng cầu là thể tích mà khối hồng cầu chiếm chỗ so với lượng máu toàn phần đã biết, khi máu được chống đông và dùng lực ly tâm làm hồng cầu lắng xuống thành một khối. Biểu thị bằng 1.
2. Máu xét nghiệm, chống đông và dụng cụ
c Máu tĩnh mạch hoặc mao mạch chưa kịp đông hay đã được chống đông bang EDTA khô 1,5mg/m].
— Dụng cụ lấy máu mao mạch (đầu ngón tay) và tĩnh mạch.
— Heparin trang Ong vi thé tích (nếu máu chưa được chống đông).
—_ Máy ly tâm vi thể tích tốc độ 10.000g/phút.
— Thước đo kèm theo máy.
— Ống ly tâm vi thể tích chuẩn.
- Matis.
3. Kỹ thuật
Nếu lấy máu mà không cho vào ống chống đông thì phải tráng ống vi thể tích bằng heparin và thấm bỏ giọt máu đầu tiên sau khi chích đầu ngón tay, nếu máu tĩnh mạch lấy vào ống chống đông thì phải trộn đều.
Nhúng đầu ống vi thể tích vào máu, nghiêng 45°-60°, dé mau mao d&n đến khoảng 3/4 chiều dài ống vi thể tích. Lau sạch máu ở đầu ống vi thể tích và gắn đầu ống bằng matis.
Để các ống vi thể tích trên khay của ly tâm vi thể tích, đầu gắn matis quay về phía ngoài. Nếu phải đợi làm hàng loạt thì để ống mao dẫn thẳng đứng trên khay matis theo số thứ tự.
Sau khi đậy nắp ly tâm cẩn thận, ly tâm 5 phút tốc độ 10.000 g/ phút.
Đọc kết quả ngay sau khi máy ly tâm dừng, bằng cách điều chỉnh mức trên và dưới của ống vi thể tích với vạch chuẩn của thước đo.
4. Nguyên nhân sai số thường gặp
— Lấy máu: Lấy cả giọt đầu khi chích máu đầu ngón tay, garô lâu quá 1 phút,
— Néng dé BDTA không thích hợp hoặc heparin bị hỏng do bảo quản.
— Máu để quá 6 giờ.
— Lắc máu không đều trước khi mao dẫn.
— Thời gian và tốc độ của ly tâm không đảm bảo.
~ Hồng cầu tự ngưng kết, vỡ hồng cầu.
Huyết tương bay hơi trong thời gian ly tâm do máy nóng quá hoặc ly tâm xong nhưng chưa đọc ngay.
~ Gắn matis chưa đủ chặt.
5. Các phương pháp khác 5.1. Máy đếm tế bào
Tất cả máy đếm tế bào từ 5 thông số trổ lên đều đo được hematocrit. Nguyên tắc cơ bản là tính hematoerit từ tổng kích cd các xung điện được tạo ra bởi hồng cầu. Đây là phương pháp cho kết quả nhanh, ổn định và chính xác nhất hiện nay.
Tuy nhiên, khi hồng cầu tự ngưng kết thì phần lớn các trường hợp máy cho kết quả hematoerit không chính xác.
5.2. Phương pháp macrohematocrit
Sử dụng ống Wintrobe, quay trên máy ly tâm thông thường. Phương pháp này tốn máu, sai số lớn, hiện nay rất ít được sử dụng.