1. Nguyên lý
Trong bệnh lý tự miễn, cơ thể tự sinh ra kháng thể chống lại các kháng nguyên của bản thân. Dựa trên nguyên lý sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu để phát hiện các kháng thể kháng nhân trong cơ thể. Ở đây, chúng tôi giới thiệu hai kỹ thuật để phát hiện: Kỹ thuật miễn địch huỳnh quang và kỹ thuật ngưng kết. Có nhiều loại tự kháng thể:
- Loại chống deroxyribonucleoprotein, biểu hiện bằng hình ảnh huỳnh quang đồng nhất phủ lên toàn bộ nhân tế bào. Hiệu giá cao rất có giá trị trong chẩn đoán và tiên lượng.
~ Loại chống phân tử ADN xoắn kép biểu hiện bằng mẫu phát quang hình
vòng (kháng thể đặc hiệu nhất cho bệnh lupus).
~ Loại chống các thành phần khác trong nhân biểu hiện bằng sự phát quang lốm đốm, tính đặc hiệu không cao trong lupus, bao gồm: kháng nguyên Smith (Sn), khang nguyên protein ribonucleo (có trong nhiều bệnh: lupus, xơ cứng bì, nhiễm collagen...), kháng nguyên Ro (do Robert phát hiện) và kháng nguyên Lane (do Lane phát hiện).
2. Phát hiện kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang 2.1. Dụng cụ, hoá chất
— Tiêu bản gắn kháng nguyên (Dùng các lam kính gắn sẵn các tế bào
nuôi cấy như tế bào Wil-2 hoặc tế bào Hep-2, hoặc dùng hồng cầu gà, hồng cầu chim xử lý trước).
Anti-IgG-FITC
— Kinh hién vi huynh quang
— Dung dịch đệm PBS
— Xanh Evans, Glycerin, lamen.
— Huyết thanh chứng:
+ Chứng dương: huyết thanh bệnh nhân lupus giai đoạn cấp.
+ Chứng âm: Huyết thanh người bình thường, càng trẻ càng tốt.
2.2. Quy trình kỹ thuật
ot Nhỏ mẫu huyết thanh cần thử, chứng dương, chứng âm lên tiêu bản đã gắn sẵn kháng nguyên.
—_ Ủ tiêu bản trong tối ở nhiệt độ phòng (30 phút)
— Dùng đệm PBS rửa sạch kháng thể thừa.
— Phủ anti-IgG-FITC
~_ Ủ 80 phút ở nhiệt độ phòng
— Rửa lại 3 lần bằng đệm PBS, để khô tự nhiên
— Nhỏ glycerin, phủ lamen, đọc kết quả trên kính hiển vi huỳnh quang
2.3. Nhận định kết quả
Xét nghiệm đương tính khi có một trong các mẫu phát quang sau:
— Mẫu phát quang đồng nhất (lan toả hoặc dày đặc): phần ánh các kháng thể chống deoxyribonueleoprotein. Nếu có hiệu giá cao thì thường có bệnh lupus ban dé hệ thống hoạt động. Khi bệnh thoái lui thì hiệu giá giảm.
- Mẫu phát quang hình vòng: phản ánh các kháng thể chống ADN kép xoắn, có tính đặc hiệu cao nhất trong bệnh lupus ban đỏ hệ thống (đễ nhận thấy khi dùng bạch cầu người làm nền).
— Mẫu phát quang lốm đốm: phản ánh nhiều loại kháng thể chống lại nhiều loại kháng nguyên là thành phần của nhân tế bào (kháng nguyén: Sm, n-RNP, Ro, La).
— Ngoài 3 mẫu phát quang trên, còn có mẫu phát quang: hạt nhân (điểm sáng tập trung trong nhân, không trải đều trên toàn bộ nhân tế bào), đây là các kháng thể chống hạt nhân.
2.4. Các yếu tố ảnh hưởng
— Độ pha loãng huyết thanh: Đối với kháng nguyên là tiêu bản tế bào Hep-2, độ pha loãng huyết thanh bệnh nhân là 1/80 để tránh đương tính giả.
— Phat quang giả: Cần luôn luôn tiến hành chứng âm và chứng dương kèm theo để so sánh kết quả.
3. Phát hiện kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật ngưng kết
Trong bộ kít phát hiện kháng thé khang n-DNA (native deoxyribonucleic acid) cia hang Human đã có đủ hoá chất và vật liệu để tiến hành phản ứng phát hiện kháng thé kháng nhân. Sau đây, chúng tôi xin tốm tắt thành phần kít và
3.1. Thành phần
— Huyền dịch hạt latex có gắn n-DNA (ọ nút trắng)
— Chứng dương (lọ nút đổ)
— Ching 4m (lọ nút xanh)
— 01 tấm nhựa có 6 ô để tiến hành phản ứng
— Que khuấy Bảo quan: 2-8°C
Mẫu thử: Dùng huyết thanh bệnh nhân cho phản ứng. Nếu huyết thanh lấy trong vòng 48 gid thi bao quan 6 2-8°C.
3.2, Quy trinh ky thuat
Mang hoá chất và huyết thanh cần thử về nhiệt độ phòng, lắc đều lọ đựng hạt latex trước khi sử dụng
Trên phiến nhựa phản ứng, đặt trong mỗi ô (giọt):
Hoá chất 61 62 63
Chứng dương 1
Chứng âm 1
Mẫu huyết thanh cần thử 1
Hạt latex gắn kháng nguyên 1 1 1
Dùng que khuấy trộn đều huyển dịch gắn kháng kháng nguyên và huyết thanh
thử (hoặc chứng đương, chứng âm), đọc phản ứng ngưng kết trong vòng 2 phút.
3.3. Nhận định kết quả
Đọc kết quả chứng trước, chứng dương có các hạt ngưng kết thằnh từng đám nhỏ và chứng âm không có các đám ngưng kết. So sánh kết quả mẫu huyết thanh cần thử và chứng đương, chứng âm để kết luận.
3.4. Các yếu tố ảnh hưởng
- Tấm phản ứng bẩn, ướt có thể làm sai kết quả, cần rửa sạch, sấy khô trước khi tiến hành phản ứng.
~ Huyết thanh bệnh nhân cần thử phải được tách cẩn thận, tránh vỡ hồng cầu.
4. Phản ứng Waaler-Rose
4.1. Nguyên lý
Phan ứng Waaler-Rose là phản ứng ngưng kết thụ động để phát hiện yếu tố dạng thấp xuất hiện trong huyết thanh của các bệnh nhân bị bệnh viêm khớp đạng thấp. Yếu tố dạng thấp là một loại protein có khả năng ngưng kết các hồng cầu đã được ủ với globulin hoặc kháng thể. Lấy huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp trộn với hồng cầu đã phủ IgG người, yếu tố dạng thấp sẽ kết hợp với IgG và kéo theo ngưng kết hồng cầu.
4.2. Dụng cụ, hoá chất
— Hồng cầu O, Rh (-) đã rửa sạch với nước muối 0,9%
~_ Huyết thanh thỏ kháng hềng cầu O
— Ống nghiệm - Pipette Pasteur
— Mẫu huyết thanh bệnh nhân cần thử.
4.3. Quy trình kỹ thuật
—_ Chuẩn bị dung dịch hệ thống phát hiện:
+ Hồng cầu O rửa 4 lần bằng NaCl 0,9%, pha thành huyền dịch hồng cầu 5%
+ Pha 1 thể tích hổng cầu 5% với 1 thể tích huyết thanh thỏ kháng hồng cầu O (đã hiệu giá), để ở tủ ấm 37°C/1 gid.
— Tiến hành phản ứng:
Trong 19 ống nghiệm được đánh số từ 1 - 12, nhỏ dung dịch theo thứ tự (Bảng 5.10).
Bảng 5.10: Độ pha loãng huyết thanh trong kỹ thuật Waaler-Rose
Ông 1 21314 5 6 7 8 9 10 1 12
Huyét = thanh| 4 | 4 bénh nhan (giot) _—>
NaCl 0,9% (giọt) 4 1414 4 4 4 4 4 4 4 4
Độ pha loãng † 1/ | 1| 1 At 1f 1/ 1i 1/ 1/ H) at 2 4 8 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048
Sau khi pha xong, cho vào mỗi ống 2 giọt dung dịch hệ thống phát hiện đã
chuẩn bị ở trên. Lắc đều, để vào tủ ấm 37°C/1 giờ.
Lấy ra xem hiện tượng ngưng kết bằng kính lõm (đọc sơ bộ kết quả lần 1) Để vào 4°C trong 18 gid, đọc kết quả lần 2.
4.4. Nhận định kết quả
Với phương pháp này:
— Nếu ở độ pha loãng 1/16 trổ xuống ngưng kết coi như phần ứng âm tinh
— Nếu ở độ pha loãng 1/32 trở nên có ngưng kết là phần ứng dương tính 4.5. Các yếu tố ảnh hưởng
— Xét nghiệm dương tính từ 70-90% các trường hợp viêm khớp dạng thấp, nhưng chỉ dương tính > 6 tháng sau khi khởi phát bệnh. Ngoài ra, xét nghiệm còn dương tính trong một số bệnh khác như xơ gan, bệnh phong, giang mai, các
bệnh hệ thống (SLE 35%, cứng bì 40%...).
~ Xét nghiệm âm tính trong một số bệnh khớp khác: Thấp khớp cấp tính,