1. Nguyên tắc: Kháng thể miễn dịch thường kết hợp với kháng thể tự nhiên.Vì vậy muốn hiệu giá kháng thể miễn dịch phải tiến hành qua hai giai đoạn:
~_ Trung hoà kháng thể tự nhiên bằng chất Witebsky hoặc khử kháng thể tự nhiên bằng cách đun nóng ở 70°C trong 10 phút.
~ Hiệu giá kháng thể miễn dịch có thể thực hiện bằng một số kỹ thuật sau:
+ Phuong pháp hiệu giá ở môi trường albumin.
+_ Nghiệm pháp Coombs gián tiếp.
+ Ky thuat xt ly héng cdu bang emzym papain, trypsin, bromelin.
2. Chuẩn bị
— Dụng cụ: Ống nghiệm nhỏ, lam kính, pipette.
— Huyết thanh xét nghiệm 5 ml.
- Héng cầu nhóm A và B mới được lấy vào ống nghiệm sạch đã có sẵn dung dịch chống đông
— Huyết thanh nhóm máu AB.
~ Chất Witebsky.
—_ Huyết thanh kháng globulin người loại y globulin
~ Huyết thanh chứng lấy ở người bình thường không có kháng thể miễn dịch.
3. Phương pháp tiến hành
3.1. Kỹ thuật trung hoà kháng thể tự nhiên
— Loại trừ kháng thể tự nhiên bằng nhiệt: trong ống nghiệm đã được ghi
nhãn (số 1) cho:
+ 0,5ml huyết thanh xét nghiệm.
+ 0,5ml dung địch nước muối 0,9%.
Trong ống nghiệm thứ 2 cho:
+ 0,õm] huyết thanh người bình thường (làm chứng).
+ 0,5ml dung địch nước muối 0,9%
Lắc đều hai ống nghiệm, đặt vào bình cách thuỷ có nhiệt độ 70C trong 10 phút.
Kiểm tra xem đã khử hết kháng thể tự nhiên chưa, bằng cách nhỏ huyết thanh trên với hồng cầu A và B (giống như hiệu giá kháng thể tự nhiên) O. Nếu ống 2 không thấy ngưng kết, chứng tổ đã loại trừ được kháng thể tự nhiên.
— Hút kháng thể tự nhiên bằng chất. Witebsky: trong ống nghiệm thứ 3 cho:
+_0,Bm] huyết thanh xét nghiệm.
+ 0,5ml chat Witebsky.
Trong ống số 4 cho:
0,5m] huyết thanh người bình thường (làm chứng).
0,5ml chat Witebsky.
Lắc đều 2 ống trên, để tủ lạnh 4°C trong một đêm, tuỳ theo quy định của hãng sản xuất chất Witebsky, kiểm tra xem đã hút hết kháng thể tự nhiên chưa (giống như trên). Sau đó hiệu giá huyết thanh đã khử kháng thể tự nhiên mà đã được hút bởi chất Witebsky.
3.2. Kỹ thuật hiệu giá kháng thể miễn dịch kháng A và kháng B
Tiến hành theo ba phương pháp sau đây:
3.2.1. Phương pháp trong ống nghiệm
— Chuẩn bị: Huyết thanh AB.
- Tiến hành: Rửa hổng cầu A và B 3 lần bằng dung dịch nước muối 0,9%, Sau lần rửa cuối cùng thì hút hết nước ở trên ra và pha thành dung dịch hồng cầu 5% với huyết thanh AB.
Dùng 20 ống nghiệm, chia làm hai dãy, pha loãng huyết thanh AB để có độ pha loãng 1/1, 1/2, 1⁄4, 1/8... 1/512, mỗi ống có 4 giọt huyết thanh AB đã được pha loãng. Sau đó cho hai giọt dung dịch hồng cầu 5% vào mỗi ống. Đối với dãy A nhỏ hồng cầu nhóm A. Đối với dãy B nhỏ hồng cầu nhóm B.
Lắc đều. Để tất cả hai đãy ống nghiệm vào trong bình cách thuỷ 379Œ/1giờ.
Quay ly tâm 2000vòng/phút/1phút trong điều kiện nhiệt độ của phòng thí nghiệm.
Sau khi ly tâm xong, phải để những ống nghiệm đó ở nhiệt độ 37°C trong 3 phút.
~ Doc két qua: quan sát hiện tượng tan máu và ngưng kết bằng mat thường.
3.2.2. Nghiệm phap Coombs gian tiếp: Huyết thanh xét nghiệm đã được ức chế kháng thể tự nhiên hệ ABO bằng chất Witebsky hoặc bằng nhiệt. Phương pháp tiến hành như sau:
— Trong 10 ống nghiệm pha loãng huyết thanh cần xét nghiệm 6 néng độ 1/1,1/2,1/4...1/512 bằng dung dịch nước muối 0,9% (mỗi ố ống có 4 giọt huyết thanh đã được pha loãng bằng nước muối 0,9%).
— Cho thêm vào mỗi ống 2 giọt dung dịch hồng cầu 5% (hồng cầu nhóm A và B đã được rửa 3 lần và được pha bằng dung địch nước muối 0,9%).
— Quay ly tâm lần thứ nhất 10 ống xem còn kháng thể tự nhiên không (thường không quá 1⁄4). Lấy những ống không ngưng kết để vào thùng cách thuỷ 37/1 Bid, lấy ra quay ly tâm 2000 vòng/phút/1phút. Quan sắt hiện tượng ngưng kết bằng mắt thường. Nếu thấy ngưng kết, chứng tỏ có kháng thể miễn dịch loại đủ.
— Lại lấy những ống không ngưng kết đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/
phúU3 phút. Hút hết dịch nổi ở trên, rồi rửa hồng cầu 3 lần bằng dung dịch nước muối 0,9%. Sau lần rửa cuối cùng thì hút hết địch nổi, rồi nhỏ vào mỗi ống 2 giọt huyết thanh Coombs, lắc đều ly tâm 1000 vòng/phút/1phút. Rồi quan sát hiện tượng ngưng kết. Hiện tượng ngưng kết ở nghiệm pháp Coombs chứng tổ sự có mặt của kháng thể miễn dịch loại thiếu.
3.2.3. Phương pháp dùng enzym: để xác định kháng thể miễn dịch chống A và B, Hồng cầu đã được xử lý bằng cnzym cho tiếp xúc với kháng thể miễn dịch loại thiếu (khang thé A va kháng thể B). Nếu xuất hiện hiện tượng ngưng kết với hồng cầu tương ứng có nghĩa trong huyết thanh của bệnh nhân có kháng thể miễn dich chống A hoặc B.
— Phương pháp tiến hành: chuẩn bị ngay dung dịch papain và khối hổng cầu rửa (A và B). Trong một số ống nghiệm nhỏ: khối hồng cầu 0,5 ml; dung dịch papain 0,5 ml.
Lac déu réi dé vao binh cach thuy 37°C, thdi gian tuy thuộc từng loại papain mà các hãng sản xuất quy định.
Rửa hồng cầu 3 lần bằng nước muối 0,9% để loại trừ hết papain (Rồi kiểm tra hồng cầu sau khi xử ly enzym xem có bị ngưng kết không, nếu có ngưng kết phải xem lại các khâu trên).
Pha dung dịch hồng cầu đã xử ly bang papain 3% trong dung dịch nước muối 0,9%,
Huyết thanh xét nghiệm đã được khử kháng thể tự nhiên đem pha loãng V/1,1/2,1/4...1/512. Sau d6 cho vào mỗi ống 2 giọt dung dịch hổng cầu đã xử lý
bằng papain 3%.
Lắc đều, để ở bình cách thuỷ 37°C/ 1giờ.
Quan sắt hiện tượng ngưng kết ngay ở điều kiện ấm, không quay ly tam.
. — Kết quả: Hiện tượng ngưng kết hồng cầu xử trí bằng papain chứng tổ có mặt của kháng thể miễn dịch loại thiếu.
. Xác định kháng thể miễn dịch hé ABO bằng nghiệm pháp Coombs gian tiép và bằng hồng cầu đã được xử lý bằng men, thường được tiến hành cùng một lúc để đối chiếu với nhau cho thêm phần chính xác, kết quả thường giống nhau.