(Fibrinogen and fibrin degradation products - FDP)
- FDP có mặt nhanh chóng trong máu ở cả hai trường hợp: tiêu sợi huyết toàn thể và tiêu sợi huyết cục bộ kết hợp với sự lắng đọng Bbrin trong lòng mạch (có đông máu trong lòng mạch).
— Trong máu người bình thường có thể có FDP dưới dạng vết, đó là kết quả của tiêu sợi huyết sinh lý. FDP cao hơn trong thời kỳ kinh nguyệt, đặc biệt ở người rong kinh. FDP cũng tăng ở người xơ gan, tac mach, nhéi máu phổi và trong
bệnh nhân ghép thận. 6 bệnh nhân ghép than, tang FDP trong nude tiểu là biểu hiện của tình trạng thải ghép.
— FDP can trd phan ứng thrombin - fibrinogen, lam kéo dai théi gian thrombin huyết tương. Huyết thanh có FDP sẽ làm tăng nhanh sự kết tụ của tiểu cầu.
- Phương pháp miễn dịch là phương pháp nhạy nhất để xác định FDP.
1. Định lượng FDP dựa vào phương pháp miễn dịch ức chế ngưng kết hồng cầu của Merskey
1.1 Nguyên lý
FDP có tính kháng nguyên, sẽ phản ứng với kháng thé khang fibrinogen người. Khi cho vào huyết thanh có FDP, khang thé khang fibrinogen người sẽ bị trung hoà và do đó giảm khả năng ngưng kết hồng cầu được gan fibrinogen (dc
chế ngưng kết hồng cầu).
1.2, Chuẩn bị thuốc thử, hoá chất và dụng cụ
1.2.1. Thuốc thữ
— Dung dịch đệm pH 7,2
KH,PO,0,15M 23,9 ml
Na,HPO,0,15M 76 ml NaCl 0,85 % 100 ml
Dung dich dém phosphat citrat pH 6,4 + 0,35 thé tich NagHPO, 0,15M
+ 0,65 thé tich KH,PO, 0,25M + 1thé tich natricitrat 0,1M
+ + +
1.2.2. Huyết thanh người bình thường và huyết thanh bệnh
— Lấy 3 mÌ máu không chống đông vào ống nghiệm có sẵn 10 mg chất ức chế: acid amino caproic (hoặc chất ức chế Kuniet).
— Để ở thùng cách thuỷ 37°C trong 3 gid.
— Quay ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, tách lấy huyết thanh.
1.2.3. Huyết tương chứng
- Trộn huyết tương citrat của những người bình thường cùng nhóm hềng
câu hệ ABO.
- Ly tâm mạnh 3000-5000 vòng/phút trong 20 phút. Bỏ cặn, định lượng fibrinogen trong huyết tương đó.
1.2.4. Huyết thanh chống fibrinogen người
— Tiêm fibrinogen người cho thỏ tạo kháng thể. Khi có hiệu giá cao đạt yêu câu thì lấy máu thỏ không chống đông, thu huyết thanh, kiểm tra bằng điện di miễn dịch và hiệu giá kháng thể trước khi lưu trữ.
1.2.5. Hồng cầu người nhóm O hoặc hồng cầu cửu
— Lấy 20ml máu, chống đông bằng 3 ml ACD hoặc citrat, máu để lưu trữ 2 ngày trước khi cảm nhiễm.
— Xử lý hồng cầu với acid tanic 1/200.000:
+ Rta hồng cầu 7 lần bằng đệm pH 7,2.
+ Pha hổng cầu 5% trong đệm pH 7,2
. + Xử lý với acid tanic: 1 thể tích hổng cầu 5 % với 1 thể tích acid tanic 1900.000, để ở nhiệt độ phòng (có thể trong gidi han 22- 37°C) trong 20 phút.
- Rửa hổng cầu 3 lần bằng đệm pH 7,3 và cuối cùng pha thành hồng câu ð % trong đệm.
1.2.6. Dụng cụ vi ngưng kết, khay nhựa nhiều hàng lỗ
1.3. Tiến hành kỹ thuật
1.3.1. Hiệu giá kháng thể
— Cảm nhiễm hồng cầu
+ Hồng cầu 5% tiếp xúc với huyết tương người pha loãng 1/250 trong dung
dịch đệm pH 7,3.
+ Hồng cầu 5% tiếp xúc với huyết thanh pha loãng 1/250
(1 thể tích hồng cầu, 1 thể tích huyết tương hoặc huyết thanh pha loãng 1/250 ủ ở 37°C trong 30 phút).
+ Rửa hồng cầu 8 lần rồi pha lai 5%.
~ Chọn nêng độ kháng huyết thanh
+ Pha loãng kháng huyết thanh bằng dung dịch đệm pH 7,2 có chứa 1%
gelatin trén hai hang 16.
+ Hàng lỗ 1 sẽ có thêm hồng cầu 5% đã tiếp xúc với huyết tương pha 1/250 + Hàng lỗ 2 có thêm hồng cầu đã tiếp xúc với huyết thanh pha 1/250 + Để ô nhiệt độ phòng, sau 1-2 giờ đọc ngưng kết
+ Néng độ kháng huyết thanh được dùng là nêng độ lớn hơn 2 độ pha loãng so với độ pha loãng cuối cùng còn ngưng kết.
1.3.2. Định lượng FDP
— Pha loãng huyết tương chuẩn (Pool đã được định lượng fibrinogen) trong đệm pH 7,2 có 1 % gelatin với nồng độ: 1/30, 1/90, 1/270, 1/540.
(Với các mẫu kiểm tra và huyết thanh bình thường (có chất ức chế) thì pha 1/3, 1/9, 1/27...).
~ Cho 0,05 ml huyết thanh ở hiệu giá đã chọn vào mỗi lỗ ủ 10-30 phút ở 4°O, thêm vào mỗi lỗ 0,05 mi hồng cầu 5% đã cảm nhiễm để nhiệt độ phòng 2 giờ.
1.4. Két qua
— Chứng dương là hàng có huyết tương chuẩn.
~ Ching âm là hàng có huyết thanh người bình thường.
— Mức độ ngưng kết ở độ pha loãng của mẫu cần kiểm tra được so sánh với huyết tương chuẩn.
Thi dụ; huyết tương chuẩn có chứa 300mg/l, fibrinogen ức chế độ ngưng kết ở 1/600 thì mỗi độ pha loãng sẽ là:
1000 1
300 x —— x — =0,ỗðug/m]l 100 6000
Nếu ức chế ngưng kết xảy ra ở 1/80 của hàng mẫu cần kiểm tra thi trong mẫu sẽ có 0,Bug/m] x 80/1 =40ug/m] FDP.
Bình thường trong huyết thanh có từ 0-5ug/m1].
1.5. Nguyên nhân sai lầm
~ Nỗng độ acid tanic không thích hợp để xử lý hồng cầu
— Kháng huyết thanh không đảm bảo chất lượng.
2. Định lượng FDP bằng phương pháp ngưng kết latex
2.1. Nguyên lý
Khi trộn huyết thanh hoặc nước tiểu với địch treo có hạt latex đã gắn kháng thể đặc hiệu chống FDP, nếu có hiện tượng ngưng kết, nghĩa là trong huyết thanh hoặc nước tiểu có FDP. Phương pháp bán định lượng được tiến hành bằng cách pha loãng mẫu xét nghiệm ở các nêng độ khác nhau.
2.2 Thuốc thử, hoá chất
Dang thrombo-wellcotest kit (Wellcome reagents LTD, Beckenham, Kent).
2.3. Tiến hành kỹ thuật
—_ Tách huyết thanh:
+ Lấy 2ml] mầu vào một ống nghiệm chuyên dụng cho xét nghiệm FƑDP (có chứa thrombin và chất, ức chế tiêu đạm để máu đông nhanh và ngăn ngừa tiêu sợi huyết invitro).
+ Để ống máu vào thùng cách thuỷ 37°C cho đến khi cục máu bắt đầu co,
quay ly tâm tách lấy huyết thanh để làm xét nghiệm.
— Thực hiện phản ứng:
+ Pha loãng huyết thanh 1/5, 1/20 với đệm glycin có trong bộ kit.
+ Lấy một giọt hỗn dịch ở mỗi độ pha loãng của huyết thanh nhỏ vào phiến kính với một giọt dịch treo latex. Lắc phiến kính nhẹ nhàng cho đến khi nhìn thấy ngưng kết các hạt latex bằng mắt thường (thời gian không quá 2 phút).
— Nếu chất xét nghiệm là nước tiểu cũng làm tương tự như huyết thanh: cho 2 ml nước tiểu vào ống chuyên dụng, đặt vào thùng cách thuỷ 37°C khoảng 30 phút, sau đó lọc nước tiểu qua giấy lọc hình đĩa (Whatman GF/B). Thực hiện phan ứng với nước tiểu không pha loãng và pha loãng 1/5.
2.4. Kết quả
— Huyết thanh: nếu xuất hiện ngưng kết ở độ pha loãng 1/5 thì lượng FDP trong huyết thanh không quá 10 ng/ml, nếu ngưng kết ở độ pha loãng 1/20 thi
- lượng FDP trong huyết thanh không qua 40 pg/ml.
—_ Nước tiểu: Nếu ngưng kết ở nước tiểu không pha loãng thì FDP không quá 2 uứ/ml, nếu ngưng kết. ở độ pha loóng 1/5 thỡ FDP khụng quỏ 10 mg/m] nước tiểu.
— Kết quả của phương pháp dùng latex tương tự với phương pháp dùng hồng cầu xử lý bằng acid tanic nhưng nó cho kết quả nhanh và tiện cho những phòng xét nghiệm không làm thường xuyên.