KỸ THUẬT KET TUA
1. Khái niệm cơ bản về kết tủa miễn dịch
Kết tủa miễn dịch là sản phẩm của phản ứng kháng nguyên - kháng thể.
Nói một cách đúng hơn thì kết tủa miễn dịch là sản phẩm của một chuỗi phản ứng kế tiếp nhau giữa hai phần tử: giữa một kháng nguyên đa hoá trị và một kháng thể đa hoá trị hoặc ít nhất là hai hoá trị (kháng nguyên và kháng thể đều ở dạng hoà tan). Cũng như phản ứng tủa trong hoá học, để có kết tủa thì phải có chuỗi phản ứng xảy ra mà chuỗi phản ứng muốn xảy ra thì cần có một phản ứng liên kết mở màn ban đầu.tạo nên một phức hợp nhỏ ban đầu cồn tan trong dung môi. Phức hợp ban đầu này làm nền để chuỗi phản ứng tiếp tục xây ra và nhờ vậy đã tạo ra một phức hợp lớn không tan kiểu “mạng lưới”.
Trong phần này, chúng tôi trình bày một số điểm cơ bản về thuyết “mạng lưới” nhằm mục đích phục vụ cho các kỹ thuật của miễn dịch-huyết học về sau.
1.1. Thuyết mạng lưới trong phản ứng kháng nguyên - kháng thể
Thuyết “mạng lưới” hay là thuyết một giai đoạn, được Marrack giới thiệu lần đầu (1938) sau đó Pauling, Pressman, Camphel tiếp tục phát triển.
Khi trộn một dung dịch kháng nguyên với một dung dịch kháng thể (kháng huyết thanh) đặc hiệu thì: đầu tiên phân tử kháng nguyên tiếp xúc với phân tử kháng thể nhờ lực liên kết đặc hiệu, biểu lộ qua tính háo và ái lực của kháng thể.
Các nhóm quyết định trên hai phân tử kháng nguyên và kháng thể phản ứng liên kết với nhau nhờ các lực như lực tĩnh điện, lực Van der Waals, cầu liên kết hydro tạo nên phản ứng đầu tiên của quá trình tủa.
Phân tử kháng thể cũng như phân tử kháng nguyên trong phức hợp ban đầu này là loại đa hoá trị, cho nên còn có các hoá trị tự do, vì vậy phức hợp ban đầu này lại liên kết với phân tử kháng thể hoặc kháng nguyên tự đo hoặc với một phức hợp ban đầu khác. Đó là chuỗi phần ứng lần thứ hai:
KT-KN+KT c› KT - KN - KT hoặc
KT - KN + KT - KN <› KT - KN - KT - KN (phản ứng lần thứ hai)
Chuỗi phản ứng liên kết lần ba cũng có thể xảy ra với một lượng lớn các phan ứng.
KT - KN - KT - KN + KT <› KT - KN - KT - KN - KT KT - KN - KT + KT - KN - KT ‹› KT - KN - KT
KT - KN - KT (phan ứng lần thứ ba) - theo Steffen (1968)
Chuỗi phản ứng lần thứ ba này xuất hiện trong trường hợp kháng thể thừa, nghĩa là khi có quá nhiều phân tử kháng thể thừa, tự do so với phân tử kháng nguyên.
Nếu nềng độ phân tử kháng nguyên và kháng thể tương đương nhau thì chỉ xảy ra phản ứng lần thứ nhất, rồi sau đó xảy ra phản ứng kiểu trùng hợp các phức hợp được tạo thành ở phản ứng lần thứ nhất.
Trong trường hợp kháng nguyên thừa thì khả năng liên kết ở phản ứng lần thứ hai kém hơn nhiều so với khi kháng thể thừa. Phức hợp được tạo thành dễ bị huỷ hoại vì các mối liên kết kém bền vững. Khi kháng nguyên quá thừa thì xuất hiện các phức hợp nhỏ hoà tan. Như vậy thuyết mạng lưới đã có một ứng dụng thực tiễn trong việc giải thích các phan ứng tủa cũng như phản ứng ngưng kết miễn dịch. Kháng thể có từ hai hoá trị trở lên mới có khả năng tạo được mạng lưới ngưng kết với kháng nguyên ; kháng thể một hoá trị (T không hoàn toàn) không có khả năng tạo được mạng lưới ngưng kết với kháng nguyên, nghĩa là không tạo được phản ứng tủa và phản ứng ngưng kết miễn dịch.
1.2. Các đường biểu diễn kết tủa 1.2.1. Đường biểu diễn Heidelberger
Heidelberger và Kendal là những người đầu tiên nêu ra phản ứng kết tủa định lượng và đã đưa ra những khái niệm về động học của phản ứng kháng nguyên - kháng thể, tỷ lệ giữa kháng nguyên và kháng thể trong phức hợp miễn dịch cũng như về số nhóm quyết định của một phân tử kháng nguyên. Những hiểu biết về sự khác nhau trong quá trình phẩn ứng định lượng tủa có một ý nghĩa quan trọng về các hiện tượng bệnh lý miễn dịch, đặc biệt là quá mẫn nhanh.
Kháng thể có khả năng kết tủa với kháng nguyên gọi là kết tủa tố, hệ thống phan ứng liên kết kháng nguyên - kháng thể gọi là hệ thống kết tủa.
Kỹ thuật định lượng phan ứng kết tủa này bao gồm:
— Cho vào các ống nghiém mét néng d6 khang thé xdc dinh réi cho vao d6 lượng kháng nguyên tăng dần lên, phản ứng kháng nguyên - kháng thể sẽ xảy ra.
Tua được loại trừ bằng ly tâm rồi tiến hành xét nghiệm kháng nguyên tự do cũng như kháng thể tự do của dung dịch trong ở trên.
— Ở ống nghiệm thứ nhất, nồng độ kháng nguyên thấp, cho nên còn thấy kháng thể còn lại ở phần dung dịch trong. Do đó gọi là ống nghiệm có kháng thể thừa, trong lĩnh vực miễn dịch thì gọi là vùng kháng thể thừa.
- 6 cae ống nghiệm tiếp theo, do tăng dần lượng kháng nguyên nên lượng kháng thể tự do của dung dịch trong ở trên liên tục giảm dần và đến một ống nghiệm mà ở đó kháng nguyên và kháng thể tương đương nhau, tất cả các kháng thể liên kết với các kháng nguyên làm cho dung dịch trong ở trên không còn kháng thể và kháng nguyên tự do, nghĩa là kết tủa hoàn toàn. Chính ở ống nghiệm này có lượng tủa lớn nhất, phức hợp tủa bền vững. Người ta gọi vùng này là vùng tương đương.
~ GO các ống nghiệm tiếp theo (sau ống tương đương) vẫn tiếp tục cho tăng dần lượng kháng nguyên lên thì thấy lượng tủa giảm xuống và phần dung dịch trong ở trên xuất hiện kháng nguyên tự do, được gọi là vùng kháng nguyên thừa.
Ở dây nồng độ kháng thể không đủ để liên kết với tất cả kháng nguyên cho nên đã tạo nên các phức hợp nhỏ kháng nguyên - kháng thể hoà tan.
Từ các kết quả trên đây có thể biểu diễn trong một hệ thống toạ độ: trục
hoành là nồng độ kháng nguyên tăng dần từ trái sang phải, trục tung là lượng tủa phát hiện. Đường biểu diễn này được gọi là đường biểu diễn tủa hay là đường biểu dién Heidelberger.
Ngành lên của đường biểu diễn Heidelberger cho thấy lượng tủa tỷ lệ thuận với kháng nguyên. Đỉnh của đường biểu diễn là vùng tương đương kháng nguyên - kháng thể. Ngành xuống của đường biểu diễn là lượng tủa giảm dần với sự tăng nêng độ kháng nguyên vỉ xuất hiện phức hợp miễn dịch hoà tan.
1.2.2. Các loại đường biểu diễn kết tủa khác
Đường biểu diễn tủa khác nhau tuỳ theo nguồn gốc của huyết thanh miễn địch và được xếp thành hai nhóm: nhóm kháng huyết thanh thỏ và nhóm kháng huyết thanh ngựa.
Trong nhóm kháng thuyết thanh thỏ, hiện tượng ức chế kết tủa chỉ xảy ra ở vùng kháng nguyên thừa, còn ở vùng kháng thể thừa và vùng tương đương thì hiện tượng kết tủa xảy ra theo tỷ lệ thuận. Ngược lại, trong nhóm kháng huyết thanh ngựa, hiện tượng ức chế kết tủa không những chỉ xảy ra ở vùng kháng nguyên thừa mà ngay cả vùng kháng thể thừa. Qua đây cho thấy huyết thanh miễn địch thuộc nhóm ngựa ít thích hợp cho hoá miễn dịch định lượng tủa. Trong khi sử dụng các loại huyết thanh miễn dịch đặc biệt, cÂn chú ý đến đặc điểm nay và với mỗi loại cần tìm và sử dụng liều lượng tối ưu trong khu vực tương đương.
1.3. Cấu tạo của phức hợp tủa
Cấu tạo của phức hợp tủa phụ thuộc trước hết vào phản ứng kháng nguyên -
nguyên quá thừa thì xuất hiện phức hợp nhỏ hoà tan, phức hợp này chi gồm hai phân tử kháng nguyên liên kết với một phân tử kháng thể.
Như vậy, trong trường hợp kháng thể thừa thì một số lớn các nhóm quyết định của phân tử kháng nguyên sẽ liên kết với các phân tử kháng thể, trong trường hợp tương đương thì còn nhiều nhóm quyết định của phân tử kháng nguyên còn tự do (không liên kết với kháng thể), trong trường hợp kháng nguyên thừa thì hai nhóm quyết định của hai phân tử kháng nguyên liên kết với một phân tử kháng thể (KN - KT - KN). Trong thực tế, để đạt được sự tương đương giữa kháng nguyên và kháng thể (kết tủa hoàn toàn), nếu cho dần dần ít một kháng nguyên vào thì tổng lượng kháng nguyên cần thiết ít hơn tổng lượng kháng
nguyên khi ta chỉ cho vào một lần (hiện tượng Danysz). Hiện tượng đó được giải thích là khi cho đần dần ít một kháng nguyên vào thì đa số các nhóm quyết định của phân tử kháng nguyên đa hoá trị liên kết với các phân tử kháng thể, cho nên lượng kháng nguyên cần thiết để kết tủa hoàn toàn đời hỏi ít hơn. Ngoài ra, do cho vào ít một kháng nguyên như vậy nên không có một số kháng nguyên bị bao vây trong mạng lưới liên kết như khi cho vào một lần.
Điều này có một ý nghĩa quan trọng đối với phản ứng độc té và kháng độc tố.
Nếu đem trộn ngay một lần một lượng độc tố với một lượng kháng độc tố tương đương thì không còn độc, nhưng nếu ta chia lượng độc tố ấy ra nhiều phần nhỏ và trộn dẫn với kháng độc tế thì còn độc vì còn độc tố tự đo chưa bị liên kết.
~1.4. Quá trình phát triển của kỹ thuật kết tủa 1.4.1 Kết tủa ở môi trường lỏng
Phần ứng kết tủa miễn dịch được Kraus mô tả năm 1897 nhưng lúc đó chỉ tiến hành ở môi trường lỏng, tức là trộn dung dịch kháng nguyên với dung dịch kháng thể trong ống nghiệm. Phương pháp trộn đơn giấn này đã phát hiện được sản phẩm phản ứng miễn địch mà niễn dịch vi khuẩn đã đầu tiên ứng dụng để phát hiện kháng thể. Uhlenhuth (1927) đã phát triển kỹ thuật kết tủa ở môi trường lỏng này với kỹ thuật kết tủa vòng (nhẫn) đơn giản. Sau đó, nhiều tác giả đã ứng dụng phương pháp này với nhiều hệ thống kháng nguyên - kháng thể khác nhau.
1.4.2. Kết tủa ỏ môi trường gel
Kết tủa trong môi trường gel hay là một trong môi trường có gia đố, là một, bước phát triển quan trọng của kỹ thuật kết tủa miễn dịch. Năm 1905, Beehhold mô tả một phản ứng có nhiều đường ngưng kết khi cho huyết thanh dê (kháng nguyên)... tần vào môi trường gel đã có chứa kháng huyết thanh đặc hiệu (huyết thanh chống huyết thanh dé toàn phần). 40 năm sau, kỹ thuật khếch tán tủa trong gel được hoàn chỉnh. Các thành phần tham gia phan ứng được khuếch tán trong gel nên gọi là khuếch tán miễn dịch, mặt khác sản phẩm của phản ứng lại kết tủa và gắn chặt trong gel nên được gọi là kết tủa miễn dịch. Gel thạch là loại
thông dụng, ngoài ra cồn có thể dùng gelatin, pectin, polyacrylamit, silicage... Sự
phát triển của phương pháp tủa trong gel đã làm ra đời một loạt các kỹ thuật:
Oudin, Ouchterlony, Mancini, điện di miễn dịch, điện đi miễn địch phóng xạ. Sau đây là một số mô hình kết tủa thường được sử dụng hiện nay (Hình 5.4 đến 5.7).