Kỹ thuật thấm ADN và lai là kỹ thuật sử dụng mẫu dé “probe” duge đánh dấu để phát hiện vị trí đoạn ADN tương ứng trên điện di sau khi ADN được cắt bằng enzym hạn chế, qua đó xác định được sự có mặt các đột biến trong ADN, Hiện nay các kỹ thuật có thể có khác nhau ở các chỉ tiết song đều dựa trên nguyên tắc đo Edward M. Southern đưa ra năm 1975.
1. Nguyên lý
—_ Dựa vào đặc điểm của các enzym hạn chế là cắt ADN ở các vị trí lựa chọn đặc hiệu, đo đó một enzym sẽ cắt ADN bộ gen người ra nhiều đoạn có độ dài khác nhau từ vài đôi base đến đoạn có hàng trăm kilo base (kb). Những đoạn này sau khi điện đi trên gel agarose sẽ ở những vị trí nhất định theo độ đài của chúng.
— Một đặc điểm nữa là ADN sẽ bị biến tính (hai, sợi tách nhau ra) đưới tác dụng của dưng dịch kiểm (NaOH) sau đó chuyển lên màng rắn với các vị trí tưởng ứng.
- Dựa trên nguyên tắc bổ sung của hai sợi ADN sau khi biến tính và trung hòa trở lại, người ta dùng các đoạn ADN đò (probe) có trình tự ADN biết trước để cho kết hợp “bổ sung” với ADN trên màng, qua đó phân tích và tìm ra đột biến.
Hình 8,5 trình bày một đột biến do tái tổ hợp làm mất đoạn ADN giữa đoạn gen A và đoạn gen B:
+ +
Binh thường enzym hạn chế cắt ở vị tri X tạo ra hai đoạn ADN:
Đoạn 3,7 kb có chứa phần gen A Đoạn 9,0 kb có chứa phần gen B
Khi đột biến (do tái tổ hợp hay chuyển đoạn, mất đoạn) enzym nay cat va tạo nên đoạn 7 kb chứa cả A và B (Hình 3.5c).
Sau khi điện đi, các đoạn 3,7 kb, 9kb,7kb ở các vị trí khác nhau. Dùng mẫu đồ (probe) Á, hoặc probe B sẽ xác định được .
128
Sen 2 He See ~x~~ ADN Với mẫu GOA Với mẫu do B
x X x
BP pee 37 kb
a: Sơ đồ đoạn AND chứa gen A, gen B và các điểm cãi (X) của
enzym hạn chế. — |3*+
Vạch
ơ TC xuất phỏt
b: Sau điện dị và lai
Gena Wit Gen B Hit ADN Vai mau độA Với mẫu a8
x x
—_. 7ko ———___—__>
c: Đoạn AND bị đột biến mất đoạn tke | —— — Ire giữa A và B, mất cả 1 vị trí cắt
của enzym hạn chế
Vach
_ TT” |huiất phát
d: Sau điện di và lai
với mẫu đó A. mẫu dò B Hình 3.5: Dùng mẫu dò (probe) phát hiện đột biến mất đoạn ADN
a, b: ở người bình thường: c, d : ở người mất đoạn gen
2. Hoa chat, dung cu
2.1. ADN: Do tach chiét ADN
2.2. Hod chat
- Rnzym (men) hạn ché: EC, RI; Hind III; Pst L.. Da sé 14 cae enzym hexacutter (nhan biét doan 6 base nito), méi enzym cé mét đệm pha thích hợp, thường hoạt động ở 37°C.
HƠI 0,5M
Agarose 1 % trong đệm TBE NaOH 0,5 M; NaOH 0,25 M NaCl 1,5 M; NaCl 0,5 M
Dung dich SSC x 20; Dung dich SSC x 2 Dém TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,6) Mang lai (mang nitrocellulose hay mang nilon) Dich lai và các sinh phẩm kèm theo
Mẫu dé
Dịch đánh dấu Glutaraldehyd Các chất hiện phim Nước cất
2.3. Dụng cụ
Hộp lai thường là loại ECL
Màng lai
Giấy sắc ký, giấy whatman Giấy thấm
Tu 4m Tủ làm đá Bề ấm
Dụng cụ điện di
3. Các bước tiến hành
3.1. Cắt ADN bằng enzym giới hạn
—_ Trong ống nghiệm Eppendorf cho:
+ 10 ng ADN trong đệm TE
+ 10 - 20 đơn vị enzym hạn chế (có thể cho 50 đơn vị) trong đệm tương ứng
— U qua dém 6 37°C
— Lấy ra một phần cho chạy điện di trén gel agarose 1%
— Nhuém và chụp ảnh kiểm tra xem ADN đã được cắt phù hợp chưa 3.2. Thdm (Southern Blot)
3.2.1. Dién di
— Dé gel agarose 1 % tao giéng nhu da néi ở trên
— Chạy điện đi ADN đã cắt với dòng điện 1V / lem chiều dài gel, thời gian 10 - 12 gid (qua đêm).
3.2.2. Xử lý gel (làm biến tính gel)
—_ Trong hộp thuỷ tỉnh cho 300 m1 HCI 0,ã M
—_ Đặt gel vào và lắc khoảng 15 phút (chú ý quan sát khi màu của dung dịch trong hộp chuyển sang màu nâu là được).
Mục đích của bước này là làm mất purin (depurination) để cắt đứt những đoạn ADN quá đài thành nhiều mảnh (nhưng vẫn nằm yên một chỗ) tạo điều kiện dễ thấm.
3.2.3. Làm biến tính ADN (Denaturation)
— Cho gel agarose vào hộp đựng dung dich I (NaCl 1,5 M; NaOH 0,5 M)
— Lae nhe trong 25 phiut, (chi ý quan sát khi dịch chuyển từ màu nâu thành màu xanh là được).
Mục đích bước này là làm hai sợi trong chuỗi xoắn kép ADN tách ra 3.2.4. Trung hoa (Neutrolisation)
Nhfc gel ra va cho vao hép dung dung dich II (NaCl 1,5 M ;NaOH 0,2 M), lắc nhẹ trong 15 phút.
3.2.5. Thấm ADN lên màng (màng niirocellulose hay màng nilon)
— Cất màng, giấy whatman, giấy lọc đúng bằng kích thước gel
- Dùng bể thấm, có thể thay bằng một khay nhựa hay khay thuỷ tính, đặt tấm ngang trên thành khay.
— Cho dung địch SSC x 20 vào trong bể (khay)
— Đặt thứ tự trên tấm chắn ngang từ dưới lên:
1. Cầu giấy thấm
9. Ba lớp giấy whatman
3. Gel đã điện đi (để úp)
4. Mang
5. Ba lớp giấy whatman 6. Nhiều lớp giấy thấm
7. Vật nang đề lên
— Để tự thấm qua đêm (khoảng 10 giở) ở nhiệt độ phòng 3.2.6. Cố định ADN lên màng
—_ 8au khi thấm, lấy màng ra, rửa nhẹ bằng dung dich SSC x 2
— Thấm khô địch trên màng
— Đặt màng dưới đèn UV thời gian ð phút (hoặc để màng giữa hai lớp giấy thấm 8 - 4 giờ) ở nhiệt độ phòng.
3.3. Lai ADN 3.3.7. Làm tiền lai
— Pha dịch lai: chuẩn bị 0,25 m1 dịch lai/ 1 cm? mang gồm dich lai, NaCl du 0,5 M, va 5% sinh phẩm đi kèm.
— Cho dịch lai vào hộp kín
~ Đặt màng vào từ từ, lắc nhẹ
— Đậy kín hộp cho vào bể ấm 42°C khoảng 1 giờ 3.3.2. Danh dau mau do (probe)
— Cho 100 ng mẫu đò ADN vào éng Eppendorf
—_ Đun trong nước sôi 5 phút (cần thận tránh bật nút)
—_ Lấy ra cho ngay vào lạnh (đá vụn)
— Cho dich danh dau (labelling reagent) với thể tích bằng thể tích mẫu đồ, trộn đều.
— Thêm glutaraldehyd với thể tích bằng thể tích dịch đánh dấu
— Để ở 3?°C từ 13 - 1õ phút 3.3.3. Tiến hành lai
— Đưa mẫu đò đã đánh dấu từ từ vào hộp đã có sẵn dịch tiển lai và màng, tránh đổ thẳng lên màng.
~ Trộn đều, để qua đêm ở 42°C
3.4. Phát hiện
3.4.1. Rửa màng lai: sau 12 đến 24 gid ủ ở 42°C
~_ Lấy ra ngâm màng lai hai lần x 10 phút trong dung dịch I
— Rửa tiếp màng lai hai lần x 5 phút trong dung dịch II (SSC x 2) ở nhiệt độ phòng (mỗi lần chuyển dụng dịch dùng giấy thấm khô màng).
3.4.2. Hiện màng
— Pha trộn thuốc hiện 1 và 2 (bán sẵn) với tỉ lệ 1: 1 lượng thuốc pha đủ 0,125 mì / em? màng.
— Tráng lên màng
— Thấm khô và úp phim X quang lên màng, ủ 1 - 2 giờ - Rửa và hiện phim
4. Đánh giá kết quả
Dựa vào thang chuẩn độ đài ADN, so sánh vị trí có probe để biết có đột biến hay không.
5. Lưu ý
Mẫu bệnh phẩm ít, kỹ thuật tiến hành qua nhiều bước nên yêu cầu hết sức cẩn thận trong các thao tác.
6. Các phương pháp khác
Nguyên tắc của “lai” là dùng các mẫu dò đặc hiệu để tìm đoạn ADN có trình tự nucleotid tương đồng nên có thể dùng trực tiếp lên NST hay sử dụng phương pháp lai Đot Blot là cho ADN lên màng, cố định không qua điện đi sau đó dùng mẫu đò gắn, rửa và phát hiện nơi có mẫu đò. Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ (FISH — Fluorescent Insitu Hybridization) để phát hiện các bất thường gen.