TRUYEN QUA DUONG TRUYEN MAU
1.1.4. Đánh giá kết quả thử nghiệm ELISA
ô Gia tri OD và giỏ trị ngưỡng
Mật độ quang (giá trị OD) của mỗi giếng được xác định khi chùm ánh sáng ở bước sóng nào đó chiếu qua đáy giếng và đo mức độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch. Để làm việc này người ta dùng phương tiện đặc biệt gợi là máy đọc phiến, thực chất là một quang phổ kế phức hợp nhiều bước sóng. Máy đọc phiến đọc các giá trị OD theo từng hàng 8 giếng và đọc đồng thời 8 giếng một lúc. Kết quả này in ra trực tiếp hoặc nối sang một máy vi tính để xử lý số liệu.
Kết quả cuối cùng của thử nghiệm ELISA là tập hợp các giá trị OD hoặc đánh giá luôn là âm tính và đương tính. Bảng 6.1 cho thấy kết quả thu được từ thử nghiệm tìm kháng thể HIV ở các mẫu huyết thanh người cho máu.
Để sử dụng được các giá trị OD, người ta phải so sánh chúng với kết quả chuẩn đã biết. Kết quả này gồm tập hợp các chứng và mẫu xét nghiệm. Có nhiều
258
cách tính kết quả khác nhau, tối thiểu cần xác định 3 điểm cho mỗi thử nghiệm ELISA. Trong đó 2 điểm là giá trị trung bình của chứng âm và chứng dương - để xác định xét nghiệm là có ý nghĩa và chúng phải nằm trong khoảng quy định của nhà sản xuất. Cuối cùng, để đánh giá kết quả phản ứng hay không phản ứng, phải tính toán giá trị ngưỡng.
Trong kiểu ELISA1 (kháng globulin và bánh kẹp giá trị OD cao sẽ có màu, và cho kết. quả “phản ứng”, còn giá trị OD thấp hay không màu là kết quả “không phần ứng”. Vì vậy, các giá trị trên ngưỡng là phản ứng và giá trị dưới ngưỡng là không phần ứng.
Trong kiểu BLISA2 (cạnh tranh) giá trị OD cao hay có màu là kết quả
“không phản ứng”, giá trị OD thấp hay không màu là kết quả “phản ứng”. Vì vậy các giá trị dưới ngưỡng là các kết quả “có phản ứng” còn các giá trị trên ngưỡng là các kết quả “không phản ứng”.
Chọn giá trị ngưỡng đúng rất quan trọng đối với thử nghiệm ELISA. Tính toán giá trị ngưỡng thường căn cứ giá trị OD chứng âm. Giá trị trung bình được tính từ mỗi chứng âm - trung bình chứng âm (Nem) va đơn giản hoa bang cách tính giá trị ngưỡng thực tế cho phiến phản ứng theo công thức sau:
Giá trị ngưỡng = Nem + 0,3
Trong thí dụ đưới đây (Bẳắng 6.1), giá trị trung bình của chứng âm là 0,16.
Giá trị ngưỡng vì vậy sẽ là 0,36 (0,16 + 0,2). Các giá trị OD nào trên 0,36 thì được cơi là có phân ứng và các giá trị OD nào đưới 0,36 được coi là không phản ứng.
Bảng 6.1: Ví dụ kết quả thu được từ kiểu ELISA kháng globulin/ kẹp.
† 0,141
2 0,158
3 0,903
4 0,161
5 0,148
Chimg am 0,156
Chứng âm 0,167
Chứng âm 0,157
Chứng dương 1,352
Chứng dương 1,283
A. Giá trị OD của mẫu và chứng.
B. Kết quả tương ứng dương tính và âm tính (bây giờ chưa cần ghi).
€. Tỷ số dấu hiệu/ngưỡng (bây giờ chưa cần ghi).
Mặt khác, giá trị ngưỡng có thể bao gôm cách tính từ giá trị OD của chứng đương và chứng âm hoặc thậm chí giá trị ngưỡng cố định của nhà sản xuất. Tuy nhiên, công thức để xác định giá trị ngưỡng được áp dụng tương tự như nhau.
1.2. Thử nghiệm ngung kết hạt 1.2.1. Nguyên lý của phân ứng
Thử nghiệm ngưng kết hạt phát hiện sự có mặt của kháng thể HIV nhờ sự ngưng kết các hạt gelatin hoặc latex đã gắn kháng nguyên HIV. Thử nghiệm này có thể được sử đụng để phát hiện HBsAg. Thử nghiệm thực biện trong các giếng, nhưng giống như thử nghiệm gắn trên bị, các giếng chỉ đơn giản là nơi thực hiện phan ứng chứ không gắn gì cả.
Một ưu điểm chung của loại thử nghiệm này là không cần các dụng cụ đất tiến. Thử nghiệm này chỉ qua ít giai đoạn, không cần rửa giếng phản ứng và có thể đọc bằng mắt. Hạt ngưng kết kháng nguyên và kháng thể được sản xuất cùng một kiểu.
a. Phat hién kháng thể: Nguyên tắc của xét nghiệm là cố định kháng nguyên HIV trên hạt vi lượng, tương tự như trên giếng hay bi được mô tả trước đây đối với thử nghiệm ELISA. Nguồn và loại kháng nguyên cũng giống như đối với ELISA mặc dù không dùng các peptid tổng hợp (Hình 6.19).
A Kháng nguyên
Hinh 6.19: Kháng nguyên được gắn trên hạt vi lượng
b. Phát hiện kháng nguyên HBsAg: Cơ số của xét nghiệm ngược với xét nghiệm phát hiện kháng thể: Kháng thể đặc hiệu được cố định trên bể mặt hạt.
Nguễn và loại kháng thể cần thiết giống như trong thử nghiệm ELISA (Hình 6.20).
.- Y Khang thé
Hình 6.20: Kháng thể được gắn trên hạt vi lượng 1.2.2. Các bước tiến hành (Hình 6.22)
Bước 1: Mẫu xét nghiệm và chứng được hoà loãng bằng dung dịch hoà loãng
mẫu (Tất cả các thử nghiệm ngưng kết hạt đều yêu cầu phải hoà loãng mẫu trước để hạn chế đến mức thấp nhất phản ứng dương tính giả). Trong một số thử nghiệm dung dịch hoà loãng rất phức tạp và luôn luôn được cung cấp trong hộp sinh phẩm.
Bước 9: Thực hiện quá trình hoà loãng trong các giếng. Chuyển ra khỏi phiến phản ứng thể tích mẫu hoà loãng ở giếng cuối cùng.
Bước 3: Thêm các hạt vào mẫu đã hoà loãng và ủ, thường là ở nhiệt độ phòng (18 - 259C) trong thời gian khoảng 1 - 2 giờ 30 phút. Trong thời gian ủ, các hạt ngưng kết lại tương tự như phản ứng giữa hồng cầu và kháng huyết thanh định nhóm máu do có kháng thể HIV trong mẫu (Hình 6.91).
A Kháng nguyên
Y khang thé
Hinh 6,21: Khang thé két hợp với kháng nguyên tạo phản ứng ngưng kết
Trong một số thử nghiệm, mẫu được kiểm tra kép bằng các hạt có gắn và không gắn kháng nguyên. Những hạt không gắn kháng nguyên dùng để xác định phần ứng không đặc hiệu.
Bước 4: Cuối giai đoạn ủ, đọc kết quả xét nghiệm. Thử nghiệm ngưng kết nói chung được đọc bằng mắt thường và kết quả ghi lại là dương tính hay âm tính.
Đọc bằng mắt thích hợp cho những thử nghiệm này vì ngưng kết của các hạt có thể nhìn thấy rõ ràng bằng mắt được. Nếu dùng hồng cầu gắn kháng nguyên thì
` sự ngưng kết hoàn toàn có thể thấy được trong giếng.
Nếu dùng các hạt gelatin gắn thì cũng thấy được nhờ màu xanh nhạt. Còn nếu dùng hạt latex thì cũng thấy rõ được các hạt màu trắng khi đặt trên nền đen.
Kết quả của phản ứng ngưng kết được trình bầy trong hình 6.32. Kết quả “có phản ứng” sẽ xuất hiện một mặt phẳng mờ, trải đều các hạt ngưng kết hoặc tạo thành bờ nham nhỏ ở đáy giếng . Kết quả “không phần ứng” sẽ xuất hiện hình nút hoặc hình vòng nhẫn của các hạt không ngưng kết lắng xuống đáy giếng (Hình 6.22).
Tiến hành thứ nghiệm
Microplate đáy hình chữ u
PCE A Pe TS
Sng 6 1 2
Lois tt 2 73 |
Ủ ở nhiệt độ phòng tong 2 gờ — -
‘gid plate khỏi bị rung trong quá trình ủ Z7 Giải thích kết quả
9œ@œ@@@@
Hình 6.22: Các bước tiến hành và nhận định kết quả trong phản ứng ngưng kết hạt
262
1.3. Các thử nghiệm nhanh
Loại thứ 3 của thử nghiệm được quan tâm là thử nghiệm nhanh, các thử nghiệm này chỉ dùng một lần và cho kết quả nhanh với độ nhậy cao. Thử nghiệm này được sử dụng để phát hiện cả kháng thể (kháng: thể HIV, HCV) và kháng nguyên (như HBsAg). Thử nghiệm đơn giản có một số kiểu khác nhau. Cơ sở là kháng nguyên hay kháng thể (tuỳ thuộc vào thử nghiệm), được bất hoạt trên màng thấm hoặc màng bán thấm, hoặc trên một dải băng. Loại này cung cấp các dạng đơn giản để dễ dàng cho mẫu thử hoặc các chất. thử khác thêm vào. Phần lớn các thử nghiệm đơn giản được chứa trong một bộ kít gồm tất cả các chất thử cần thiết để tiến hành kỹ thuật, các thử nghiệm nhanh này có thể dùng huyết thanh hoặc huyết tương và trong một số trường hợp có thể dùng cả máu toàn phần. Các thủ nghiệm này có thể chia thành 3 nhóm theo nguyên tắc sau đây. Nhìn chung các nguyên tắc này bao gồm sự trình bày của kỹ thuật.
— Miễn dịch sắc ký
— Lọc miễn địch
— BLISA thông thường
Sau đây là các ví dụ về nguyên tắc chung, phương pháp và ứng dụng của ba nhóm khác nhau. Sự khác nhau của ba nhóm được phản ánh trong thiết kế và xây dựng bởi các nhà sản xuất hơn là sự khác nhau về nguyên tắc được chấp nhận.