KỸ THUẬT KET TUA
4. Kết tủa định lượng
4.1. Bán định lượng hiệu giá kháng thể, kháng nguyên
Xác định hiệu giá kháng thể, kháng nguyên dựa trên hai phương pháp cơ bản:
4.1.1. Phuong phap alpha (ky thuat Dean va Webb)
Cho vào mỗi ống nghiệm lượng kháng thé bằng nhau xác định, sau đó cho lần lượt từ ống thứ nhất trở đi một thể tích kháng nguyên có độ pha loãng tăng dần.
4.1.2. Phương pháp beta (kỹ thuật Ramon)
Cho vào mỗi ống nghiệm lượng kháng nguyên xác định bằng nhau, sau đó cho lần lượt từ ống thứ nhất trở đi một thể tích kháng thể có độ pha loãng tăng dần.
Hiệu giá chính là độ pha loãng của ống có kết tủa rõ.
Thí dụ: Xác định hiệu giá của huyết thanh miễn dịch (kháng một kháng nguyên nào đó) ta có thể tiến hành như sau:
Nếu kết tủa xuất hiện rõ ở ống số 9 chẳng hạn thì hiệu giá của kháng huyết thanh miễn dịch này là 1: 512. Tuy nhiên sự kết tủa đầu tiên (tỷ lệ kháng thể/
kháng nguyên) còn phụ thuộc vào nồng độ chung của hỗn hợp kháng nguyên khang thé. Phuong pháp trên đây có nhanh chóng cho kết qua Song có thể bị sai lạc bởi hiện tượng kết tủa không đặc hiệu như phan ứng chéo của các kháng nguyên đối với kháng thể. Vì thế, để xác định hiệu giá của kháng thể và kháng nguyên, đồng thời giúp phát hiện các phản ứng chéo hoặc sự tỉnh khiết của kháng nguyên, kháng thể thì người ta thường dùng phương pháp ngưng kết trong gel (kỹ thuật Ouchter lony) sé trinh bay dudi day.
Bảng 5.8: Tỷ lệ pha loãng KT trong kỹ thuật tủa định lượng
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dung dich khang nguyén0,2 0,2 02 02 02 02 02 02 O02 0/2 02 0,2
5mg/ml
0/2ml dung dịch kháng11:2 114 186 1:16 1132 1164 1:128 1:256 1:612 1:1024 1.2048 1:4096 thể có độ pha loãng
4.2. Các phương pháp kết tủa định lượng
Lý thuyết về đường biểu diễn kết tủa của Heidelberger và Kendall đã chỉ rõ, phản ứng kết tủa xảy ra tốt nhất ở vùng tương đương giữa kháng nguyên và
kháng thể. Do đó có một số tác giả trước khi định lượng kết tủa, còn tiến hành thử nghiệm cơ bản để xác định vùng tương đương của kháng nguyên, kháng thể.
4.2.1. Thử nghiệm chuẩn bị
Để xác định vùng tương đương, cho vào mỗi ống nghiệm 0,4ml dung dịch kháng nguyên có nềng độ tăng dần (50, 100, 200, 400 pg/ml; cé thé tang dén 2000- 3000 pg/ml) và dung dich khang thể có nồng độ cố định (0,4m]).
Để tất cả các ống nghiệm ở 372C trong 60 phút và qua một đêm ở 4°C. Các ,ống nghiệm được ly tâm 30 phút với tốc độ 2000-3000 vòng/phút, ác định
kháng nguyên thừa và kháng thể thừa của dung dịch trong nước nổi ở trên.
Ống nào có lượng kết tủa nhiều nhất, không còn kháng nguyên thừa và kháng thể thừa ở phần dung dịch ở trên nữa, thì đó là phạm vi tương đương của kháng nguyên, kháng thể.
4.2.2. Thử nghiệm chính thức
Định lượng lượng kết tủa của một hệ thống phần ứng kháng nguyên kháng thể đòi hỏi kháng huyết thanh phải có chất lượng cao. Tổng thể tích của hỗn hợp không quá 3-4ml. Đối với kháng huyết thanh có hiệu giá thấp thì phải kéo dài thời gian kết tủa 6-8 ngày ở 4°C và có thể cho tăng thể tích kháng thể.
a. Nguyên lý của phương pháp
Rết tủa được tạo thành sau phần ứng kháng nguyên - kháng thể, được rửa với dung dich NaCl 0,9% lanh va hoa tan trong NaOH 0,1N réi tiến hành định lượng protein của tủa bằng phugng phap vi Kjeldahl, phan tng Folin hodc phuong pháp đo mật độ quang ở bước sóng 280nm.
b. Dụng cụ, hoá chất
Ống nghiệm, ống hút chia độ
— Kháng huyết thanh, kháng nguyên NaCl 0,9%, NaOH 0,1N
c. Tiến hành
~_ Chuẩn bị kháng huyết thanh và kháng nguyên:
+ Khử hoạt bổ thể của kháng huyết thanh (30 phút ở 56°C).
+ Pha cdc dung dich khang nguyén 5-10% trong nước muối sinh lý (0,9%)
— Phản ứng kết tủa:
Ống thử Ống chứng
+ Kháng huyết thanh khửhoạt 0,4ml 0,4m]
+ Dung dịch kháng nguyên 0,4ml
+ NaCl 0,9% 0,4ml
190
Có thể tiến hành thêm một ống chứng thứ hai: 0,4m] dung dịch kháng nguyên + 0,4ml NaCl 0,9% để xem có hiện tượng kết tủa làm sai lệch kết quả không.
Để tất cả các ống 6 37°C trong 30 phút và 24-48 giồ ở 4°C. Trong thời gian đó thỉnh thoảng phải lắc nhẹ.
4.2.3. Rửa và hoà tan tủa
Các ống được ly tâm 2000 - 3000 vòng/phút x 30 phút. Nhẹ nhàng chắt phần dung địch trong sang một ống nghiệm khác để kiểm tra kháng nguyên, kháng thể thừa. Phần cặn được rửa 2-3 lần với NaCl 0,9% lạnh, mỗi lần hoà cặn với 1-2ml NaC! 0,9% lanh, ly tam va chat bé phan dung dich trong ở trên.
Hoà cặn với NaOH 0,1N để tiến hành định lượng. Đầu tién cho 0,5ml NaOH
0,1N hoà cặn, sau đó cho thêm dần để tổng thể tích khoảng 9-3ml.
4.2.4. Định lượng protein tủa
Sau khi hoà tan cặn, có thể tiến hành định lượng protein của tủa bằng cách:
— Định lượng nitơ của tủa bằng phương pháp vi Kjeldahl. Từ lượng nitơ tính được lượng protein bằng cách nhân với 6,25. Phương pháp này chính xác nhưng phiền phức và mất thời gian, nên chỉ để tiến hành với chuẩn.
- Phản ứng Folin, khá nhạy nhưng mật độ quang thay đổi đối với các protein khác nhau, khác biệt tới ð0%. Do đó phải tiến hành song song với chuẩn kháng nguyên, kháng thể cùng loại để điều chỉnh kết quả.
=_ Phương pháp do mật độ quang ở bước sóng 280mm. Phương pháp này đơn giản nhưng hệ số mật độ quang cũng thay đổi tuỳ theo loại protein.
Thí dụ: E 1% ở pH = 7 thì đối với albumin ở bước sóng 280nm là 5,8, đối với gamma globulin là 13,8... Đo mật độ quang so với ống trắng là NaOH 0,1N.
4.2.5. Kiểm tra dung dịch trong ở trên
Kháng nguyên thừa Kháng thể thừa
Dung dich trong 0,3m] 0,3ml
Kháng huyết thanh 0,1m]
Kháng nguyên 5-10 ng
(trong 0,1m1 NaCl 0,9%)
Nếu không có kháng nguyên thừa và kháng thể thừa ở phần dung dịch trong là quá trình định lượng đã tiến hành tốt ở vùng tương đương, kết quả đảm bảo chính xác. Nếu có kháng nguyên thừa hoặc kháng thể thừa, phải điều chỉnh lại.
4.2.6. Ứng dụng của phương pháp
Tính được lượng kháng thể ngưng kết trong kháng huyết thanh (lấy tổng lượng tủa trừ đi lượng kháng nguyên cho vào đã xác định trước).
Tính được tỷ lệ kháng nguyên/kháng thể ở vùng tương đương hoặc vùng kháng thể thừa. Đặt cơ sở cho việc điều chế phức hợp kháng nguyên, kháng thể có
Phương pháp được áp dụng để định lượng kháng độc tố và độc tố vi khuẩn, có thể áp dụng nghiên cứu bệnh lý thực vật và thú y. (Kháng nguyên là các chất
chiết xuất, kháng thể là huyết thanh động vật được gây mẫn cảm bằng kháng
nguyên tương ứng).