(kỹ thuật dinh nhém HLA)
1. Nguyén ly
Kháng nguyên bạch cầu ngudi (Human Leucocyte Antigens - HLA) 1a hé kháng nguyên mang tính đặc hiệu loài. Hệ kháng nguyên HLUA có thể sử dụng như một dấu ấn nhân chủng học và dấu ấn bệnh lý. Kháng nguyên HLA lớp I (HLA-A, HLA-B, HLA-C) duge phat hién bang kỹ thuật vi độc tế bào. Kháng
nguyên HLA lớp II (HLUA- DR, DP, DQ) được phát hiện bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction).
2. Quy trinh ky thuat
2.1. Kỹ thuật vi độc lympho
2.1.1. Dụng cụ hoá chất
—_ Khay nhựa nuôi cấy tổ chức (Terasaki)
— Bơm tiờm Hamilton gồm ọ cừ: 100, 250, 500 microlit
— Pipette Pasteur, kính hiển vi - Ong ly tam cd 1x 10cm
— Dung dich Hanks pH 7,3; nước muối sinh lý - Dung dich formalin 35% c6 pH 7,2
- Dung dich xanh trypan 0,2% (pha trong nước muối sinh lý)
— Dung dich ficoll tach bạch cầu.
2.1.2. Khang huyét thanh chéng lympho bao
Kháng huyết thanh lấy từ các cá thể truyền máu nhiều lần hoặc máu của các bà mẹ chửa đẻ nhiều lần có bất đồng hệ kháng nguyên HLA giữa mẹ và con hoặc kháng huyết thanh được sản xuất theo phương pháp kháng thể đơn dòng của các labo HLA trên thế giới đã được thương mại hoá. Kháng huyết thanh được khử bổ thể ở 56°C/30 phút. Bảo quản ở - 80°C.
2.1.3. Bổ thể: thường dùng bổ thể thỏ. Lấy máu động mạch thỏ, tách huyết thanh bằng ly tâm 3000 vòng/phút/15 phút ở 4°C. Huyết thanh thổ được hấp phụ một lân với hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu của người có nhóm máu AB, Lấy máu AB, rửa 3 lần bằng NaCL 0,9%, lấy cặn tế bào ủ với huyết thanh thỏ 1 gid 6 4°C, thé tích như nhau. Sau khi hấp phụ, ly tâm 3000 vòng/phú/15 phút ở 4°C. Lấy nước mặt (huyết thanh thỏ) bảo quản ở -80°C.
2.1.4. Tiến hành tách bạch cầu: như trong kỹ thuật độc tế bào.
2.1.5. Tién hanh phan tng
Dùng phiến nhựa có lỗ, tiến hành phần ứng như sau:
— Nhỏ đều dầu paraphin vào mỗi lễ (1ul)
Cho 1 gl dung dịch kháng huyết thanh vào mỗi lỗ
Cho 1 gì dụng dich bạch cầu Bx109, trộn đều, sau đó để 30-45 phút ở nhiệt độ phòng.
— Cho thém 5 pl bé thé thd, ủ 37°C từ 60 - 90 phút, lấy ra vấy sạch dầu paraphin, cho vào mỗi lỗ 2 HÌ xanh trypan đã pha ở trên, trộn đều, để nhiệt độ phòng ð phút
— Lắc đều, để nhiệt độ phòng 5 phút
— 5 ul formalin dé cố định tế bào.
~ Doc két qua trén kính hiển vi đảo ngược 2.1.6. Nhận định kết quả
Bạch cầu chết là những bạch cầu ngấm độc, trương to, bất màu xanh. Đếm số tế bào chết và tính tỷ lệ:
~ Từ 0-15% là C)
~ TY 15 - 20% la (4)
~ Từ 20 - 30% là (+)
— Từ 30 - 50% là (++)
— Từ 50 - 80% là (+++)
— Từ 80% trở lên là (++++)
Đối chứng: Gồm chứng đương và chứng âm:
Chứng dương: dùng kháng huyết thanh ở độ pha loãng 100% tế bào chết Chứng âm: chỉ có lympho, không có kháng huyết thanh.
Khi đọc kết quả, cần đọc chứng trước.
2.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả
— Mật độ tế bào bạch cầu
— Hiệu giá bổ thể
— Néng dé xanh trypan
~ Nhiệt độ phản ứng
— Cường độ đòng điện điện di 2.2. Kỹ thuật PCR
2.2.1. Nguyên lý
Nhờ cặp mỗi đặc hiệu (Primer), một đoạn DNA được tổng hợp từ nguồn nguyên liệu là các nueleotid tự do với sự xúc tác của DNA polymerase.
2.2.2. Dung cu, hoa chat May PCR
May dién di
Lay ly tam
Tủ ấm (có thể điều chỉnh nhiệt độ 37°C và 529G)
Máy lắc
Máy đọc kết quả điện di (có ánh sáng đèn UV) Các loại micropipette
Ống Eppendof (1 m] và 1,ðm]) Dung dịch phá hồng cầu, bạch cầu Proteinase K, NaCl 0,9%
Ethanol 99%, Agarose Ethidium bromid
DNA size marker, d NTD DNA polymearase
Primer (tuỳ thuộc đoạn DNA cần khuếch đại) 2.2.3. Quy trình kỹ thuật
Chiết tách DNA
Gó rất nhiều phương pháp chiết tách DNA khác nhau nhưng nói chung đều theo một số bước cơ bản sau:
Lấy mau tĩnh mạch, chống đông bằng EDTA (3 - 5m]) Phá hồng câu, bạch cầu
Xử lý bạch cầu đã được phá bằng proteinase K
Tua protein bang dung dich NaCl bao hoa
+ Loại bỏ tủa protein bằng ethanol 99%
+ Tai hoa tan tha DNA trong dém TE (Tris-EDTA) Thực hiện quá trình khuếch đại
Số chu kỳ khuếch đại, nhiệt độ và thời gian của các giai đoạn trong một chủ kỳ hoàn toàn phụ thuộc vào từng cặp mỗi. Quá trình này thường gồm các bước cơ bản sau:
Chuẩn bị hỗn hợp khuếch đại: tổng thé tich 50 - 100 yl (dang eppendorf chuyên dụng), các thành phân trong hỗn hợp bao gim: DNA, DNA polymerase, đNTP, primer (có thể thêm một vài thành phần khác tuỳ theo hướng dẫn của nhà sẵn xuất).
Thực hiện sự khuếch đại trên máy chuyên dụng: thường có số chu kỳ khuếch đại là 30 -60 (tuỳ theo từng kỹ thuật}.
- Mỗi chu kỳ gầm 3 giai đoạn: giai đoạn tháo chuỗi xoắn kép của DNA tạo chuỗi đơn DNA. giai đoạn gắn cặp môi vào chuỗi đơn DNA, giai đoạn kéo dai chuỗi bổ cứu mới được tổng hợp.
— Điện đi kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sản phẩm khuếch đại được kiểm tra bằng điện di trên gel thạch agarose, kết quả được xem là dương tính khi thấy vệt trắng đục trên đường chạy của sản phẩm trong gel thạch.