KỸ THUẬT KET TUA
5. Kết tủa trong gel
Kết tủa miễn dịch trong gel là hiện tượng kháng nguyên, kháng thể (hoặc cả hai) khuếch tán vào một lớp gel và ở một vị trí xác định của gel xuất hiện đường kết tủa hoặc vùng kết tủa của kháng nguyên kháng thể.
Sự tạo thành kết tủa cũng như vị trí kết tủa phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
Trước hết, nó tuân theo định luật khuếch tán trong môi trường lỏng của Fiek 2 cũng như hệ số khuếch tán, có nghĩa là phụ thuộc vào tính chất của kháng nguyên, khang thé, néng độ và trọng lượng phân tử của kháng nguyên, kháng thể. (Đường kết tủa nằm gần vị trí kháng nguyên hơn nếu kháng nguyên có trọng lượng phân tử cao hơn trong lượng phần tử kháng thể, và ngược lại). Ngoài ra còn phụ thuộc vào pH, ion lực, nhiệt độ, thời gian.
Ưu điểm của phương pháp. Với phương pháp kết tủa trong gel, có thể tiến hành nghiên cứu hệ thống kháng nguyên, kháng thể đa giá. Trong môi trường gel hỗn hợp, kháng nguyên và kháng thể đa giá sẽ cho nhiều đường tủa độc lập bởi đặc tính khuếch tần và điện đi khác nhau của chúng.
Khuếch tán trong gel giúp cho sự đánh giá một cách chính xác độ tình khiết của kháng nguyên kháng thể, phát hiện được tính đồng tính, phản ứng chéo... của các kháng nguyên. Các đường tủa được gắn trong gel làm cho việc đánh giá kết
`quả và lưu lại được thuận lợi. Kết tủa miễn dịch trong gel, ngoài tác dụng xác định định tính, còn dùng định lượng cũng như bán định lượng kết tủa miễn dịch.
Chúng tôi chỉ giới thiệu những kỹ thuật thông dụng nhất.
5.1. Khuéch tan vòng đơn gián (kỹ thuật Mancini)
Kỹ thuật khuếch tán miễn địch vòng trong gel thach duge Mancini, Carbonara và Heremans nêu ra năm 1965 với một hệ thống so sánh để xác định định lượng kháng nguyên từ một ngưng kết miễn dịch đặc hiệu.
8.1.1. Nguyên tắc của phương pháp
Kháng nguyên hoà tan từ một lỗ hình tròn khuếch tán ra xung quanh một cách đều đặn vào một lớp gel thạch có độ đày nhất định chứa kháng thể tương ứng. Sự tiếp xúc kháng nguyên với kháng thể tương ứng đặc hiệu sẽ tạo thành một vùng kết tủa hình tròn không tan.
Diện tích hình tròn tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên.
Phương pháp Maneini được sử dụng trong hoá miễn dịch để định lượng các protein trong một hệ thống kháng huyết thanh đơn đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Thí dụ định lượng IgG, IgA véi khang huyết thanh đơn đặc hiệu kháng IgG, khang IgA.
5.1.2. Thiét bi, nguyén liéu, hoa chat
— Bàn thăng bằng, buồng ẩm,
Thước kẹp đo hoặc kính hiển vi có thước đo.
— Giấy kẻ ô ly (mm)
_ Ống nghiệm, ống hút vị lượng, ống hút chia độ
~_ Đĩa thuỷ tỉnh có đường kính 8,ðem, hoặc các phiến kính phẳng 8 x 10em
— Thạch 1,5% trong đệm 8,6 với ion lực 0,1
— Kháng huyết thanh đơn đặc hiệu, kháng nguyên chuẩn -_ Huyết thanh cần thử (huyết thanh bệnh nhân)
— NaCl0.9%
Dung dịch nhuộm: có thể dùng dung dich 0,5% Amidoschwarz 10B (trong methanol: acid acetic tỷ lệ 9:1) hoặc dung dịch 0,2% xanh Coomassie trong nước.
— Dung dịch cố định: acid acetic 2% trong nước hoặc acid tricloacetie 13,5%.
—_ Dung dịch rửa: methanol/acid acetie (9/1) hoặc ethanol/acid aceticinước (4/1/B)
§.1.3. Tiến hành
— Điều chế thạch chứa kháng thể. Đun sôi cách thuỷ thạch 1,õ% để thạch tan ra, sau đó để vào nổi ấm cách thuỷ 56ˆC để nhiệt độ thạch giảm xuống gần 56C. Đồng thời để kháng huyết thanh vào nổi cách thuỷ ấm 5Œ.
Cho vào ống nghiệm hoặc lọ penicillin một thể tích thạch và kháng huyết thanh theo tỷ lệ: kháng huyết thanh trong thạch là 2-5%, hoặc có thể 10%. Tất cả đều tiến hành ở ã6”C.
— Đổ thạch chứa kháng thể vào đĩa thuỷ tỉnh có đầy phẳng và đặt lên mặt phẳng đã thăng bằng, làm sao thạch đàn đều đặn có độ dày khoảng 2mm; để ở nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau đó để vào tủ lạnh (4 ”C) khoảng 90 phút cho thạch đông tốt.
~_ Đục lễ. Dùng khuôn hoặc một ống có đường kính 2mm đục các lỗ trên bản thạch đục và hút phải cẩn thận để lỗ thạch tròn, nhẫn và sạch. Khoảng cách giữa các lễ từ: 7-10mm tuỳ nồng độ kháng nguyên của mẫu thử.
— Cho dung địch kháng nguyên vào lỗ. Bằng ống hút vi lượng, cho vào mỗi lỗ 3-5 mierolit dung địch kháng nguyên (mỗi lỗ là một mẫu kháng nguyên, tức là mỗi mẫu huyết thanh bệnh nhân). Tuỳ theo yêu cầu mà pha loãng huyết thanh.
(Thí dụ: để định lượng IgG thì huyết thanh bệnh nhân cần pha loãng 1/10, định lượng IgAÁ thì pha loãng 1/2, còn định lượng IgM không pha loãng.
Đồng thời cho vào ba lỗ ba nêng độ kháng nguyên chuẩn tương ứng đã biết rõ nồng độ để vẽ đường chuẩn.
Thời gian khuếch tán: để vào hộp có độ ẩm cao (bão hoà hơi nước) ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
Loại bỏ protein thừa không ngưng kết: ngâm 2 ngay trong NaCl 0,9%, hang ngày thay 3 đến 3 lần dung dịch NaCl 0,9%.
Cố định: ngâm 30 phút trong dung dịch acid acetie 2%.
Nhuộm màu: ngâm 10 phút trong dung dịch 0,5% Amidoschwarz 10B hoặc Coomassie 0,2%,
Loại bỏ màu thừa. Ngâm lần lượt ở nhiều chau methanol: acid acetic (9:1) hoặc ethanol: aeid acetie nước (4:1:5) mỗi lần khoảng 2 phút.
Để khô ở nhiệt độ phòng.
5.1.4. Đọc kết quả
Dùng thước kẹp ly mét hoặc kính hiển vi có chia độ để đo đường kính khuếch tán.
Vẽ đường biểu diễn. Căn cứ vào nêng độ kháng nguyên chuẩn biết trước và đường kính đo được của các nỗng độ kháng nguyên chuẩn, ta vẽ được đường biểu điễn trên giấy kẻ ly (ít nhất phải có 3 điểm). Từ đó tính ra nồng độ kháng nguyên tương ứng của mẫu thử.
Có thể vẽ đường chuẩn theo các cách sau đây: Thí dụ:
— Đường kính khuếch tán IgG của huyết thanh bệnh nhân A là 5mm.
— Nồng độ IgG tương ứng trên trục hoành là 30,
— Độ pha loãng huyết thanh: 40
Vậy: nồng độ IgG của huyết thanh bệnh nhân Á là: 30 x 40 = 1200mg/100m]l.
5.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng
- Không để thăng bằng trong quá trình làm và quá trình khuếch tán nên lớp thạch dày mồng khác nhau do đó khuếch tán không đều, diện khuếch tan méo mó, lỗi lõm hoặc hình bầu dục.
— Đổ thừa dung dịch kháng nguyên tràn ra ngoài lỗ hoặc nồng độ kháng nguyên quá thừa làm cho diện khuếch tán mờ, giới hạn không rõ (do tạo phức hợp tan).
~ Để ở nhiệt độ quá cao không đủ độ ẩm nên thạch bị khô, ảnh hưởng đến tốc độ khuếch tán.
—_ Thời gian khuếch tán để quá lâu mà khoảng cách giữa các lễ thì bé nên có thể xây ra hiện tượng khuếch tán chồng lên nhau.
— Huyết thanh có nhiều lipiđ hoặc có nhiều fibrinogen gây nên sự kết tủa tự phát.
5.1.6. Giới hạn của phương pháp
Phương pháp này chỉ phù hợp đặc biệt đối với việc nghiên cứu định lượng các
protein trong trạng thái sinh lý, bệnh lý mà có trọng lượng phân tử không quá lớn.
Để khắc phục sự không đều đặn của lớp thạch khi đổ, chúng tôi đã dùng hai miếng kính phẳng chồng lên nhau và lót giữa hai kính ở ba cạnh những băng nhỏ
chất dẻo hoặc cao su dày độ 1,5-2mm và cố định chặt bằng cặp phơi quần áo. Như vậy hai miếng kính phẳng đã cách nhau khoảng 2mm, ba phía đã kín, còn một phía không lót cao su là khu vực để đổ thạch chứa kháng thể. Sau khi đổ thạch chứa kháng thể vào thì để nghiêng khoảng 30° trong 10 phút ở nhiệt độ phòng rồi để vào tủ lạnh 4C trong 20 phút cho thạch chứa kháng thể đông tốt. Sau khi thạch đã đông tốt thì bô đi một phiến kính bằng cách vừa miết nhẹ nhàng phiến kính đó trên lớp thạch, vừa kéo ra. Ta sẽ được một lớp thạch chứa kháng thể dày khoảng 2mm nằm lại trên phiến kính kia. Tiến hành đục lỗ và cho kháng nguyên vào các lỗ như phần trên.
5.2. Khuốch tán vòng kép
Từ 1949, kỹ thuật Ouchterlony được ứng dụng một cách phổ biến trong
nghiên cứu kết tủa miễn địch bởi kỹ thuật khá đơn giản và cho kết quả nhanh, 5.2.1. Nguyên lý của phương pháp
Kháng nguyên và kháng thể hoà tan từ hai vị trí khác nhau khuếch tán vòng vào trong môi trường gel thạch tạo nên những đường kết tủa hình cung khi kháng nguyên và kháng thể tương ứng tiếp xúc nhau.
Hình dạng độ cong của đường tủa phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của phân tử kháng nguyên và phân tử kháng thể.
§.2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
~_ Mặt phẳng thăng bằng, buồng ẩm như đối với kỹ thuật Mancini.
~_ Hộp quan sát với nền đen, lam kính, bình nón
— Ống hút chia độ: 0,1m1, 1ml, 5m], 10ml - Ong hút mao quản, khuôn đục lễ
— Dung dịch thạch 1,5% trong dém pH 8,6 ion lực 0,05.
— Dung dịch kháng nguyên: huyết thanh bệnh nhân hoặc các thành phần protein.
— Kháng thể: kháng huyết thanh tương ứng.
— NaCl 0,9%
— Dung địch nhuộm và dung dịch rửa như trong kỹ thuật Mancini.
5.2.3. Tiến hành
— Chuẩn bị các lam kính. Các lam kính được rửa và lau khô sạch, đánh số và đặt lên trên mặt phẳng thăng bằng.
— Đun sôi cách thuỷ dung dịch thạch 1,õ% để thạch tan đều.
— Dùng ống hút dải lên mỗi lam kính 3,õml thạch làm sao cho lớp thạch dan đều và có độ dày khoảng 3mm. Để ở nhiệt độ phòng cho thạch đông lại, sau đó để vào tủ lạnh khoảng 15-20 phút cho thạch đông chắc.
Nếu chưa kịp làm thí nghiệm thì để các lam thạch vào buồng ẩm.
— Đụe lỗ. Dùng khuôn hoặc các ống đồng để đục các lỗ trên bản thạch.
~ Dùng ống hút mao quản cho kháng huyết thanh đây lỗ giữa, còn các lỗ xung quanh cho đầy dung địch kháng nguyên có độ pha loãng khác nhau.
~ Để các lam kính vào buông ẩm trên một tiết diện bằng và ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
5.2.4. Đọc kết quả
Dùng ánh sáng tự nhiện hoặc hộp quan sát (hộp có bóng đèn, đáy nền đen và
trên là mặt kính) để đọc kết quả các đường kết tủa.
Để tiến hành định lượng tiếp hoặc để giữ làm tài liệu thì loại protein thừa không ngưng kết (ngâm 2 ngày trong dung dịch NaCl 0,9%). Sau đó nhuộm 10 phút với dung dịch Amidoschwarz và rửa bằng hỗn hợp ethanol: acid acetic + nước và để khô như đối với kỹ thuật Mancini.
5.2.5. Ứng dụng của kỹ thuật Ouchterlony.
— Kiém tra độ tình khiết của kháng nguyên. Để tiến hành kiểm tra độ tính khiết của một hỗn hợp kháng nguyên hoặc một kháng nguyên đơn giá (một thành phần protein) sau khi được điều chế thì người ta có thể sử dụng kỹ thuật Ouchterlony.
Để có kết quả chính xác, cần pha loãng kháng nguyên thành nhiều nồng độ khác
nhau để có thể tạo được một phạm vì tương đương của kháng nguyên, kháng thể.
— 8o sánh các kháng nguyên. Kỹ thuật Ouchterlony giúp cho việc nghiên cứu so sánh tính đồng nhất (sự giống nhau) phản ứng chéo và tính khác loại của hai kháng nguyên.
Nhóm 1: Cả hai kháng nguyên hoàn toàn giống nhau, tức là chúng có cùng nhóm quyết định của kháng nguyên, đo đó hai đường tủa khép kín (tính đồng nhất).
Nhóm 9: Không đồng nhất. Hai kháng nguyên có những nhóm quyết định khác nhau nghĩa là mỗi một kháng nguyên phản ứng với một thành phần kháng thể trong kháng huyết thanh. Hai đường tủa cắt nhau.
Nhóm 3: Đồng nhất một phần thứ nhất. Hai kháng nguyên có chung một nhúm quyết định. Ngoài ra khỏng nguyờn ẽ cũn cú một nhúm quyết định phản ứng với một thành phần kháng thể chứa trong kháng huyết thanh mà ở kháng nguyên II không có. Kháng thể chống lại nhóm quyết định này tạo thành một đường kết tủa đi qua kháng nguyên II cho hình ảnh một cựa gà.
Nhóm 4: Đồng nhất một phần thứ hai. Hai kháng nguyên có chung một nhóm quyết định. Đồng thời mỗi kháng nguyên lại có một nhóm quyết định khác nhau và phản ứng với hai thành phần khác nhau trong kháng huyết thanh và tạo nên hình anh "eva gà kép". Loại đồng nhất một phần này tương đối khó phân biệt với nhóm không đồng nhất.
5.3. Kỹ thuật điện di miễn dịch (xem bài riêng)