1. Nguyén ly
Kháng nguyên biét hoa (cluster differentration antigen) ky hiéu CD hiểu theo nghĩa rộng bao gồm tất cả các loại protein xuất hiện trên bể mặt tế bào bạch cầu trong suốt trong quá trình biệt hoá từ khi được sinh ra từ tế bào nguồn (stem cell) đến khi hoàn thành chức năng. Phát hiện được các kháng nguyên biệt hoá
giúp nhận biết được giai đoạn phát triển của từng loại tế bào cũng như quá trình bệnh lý của chúng. Một trong những ứng dụng cơ bản của kỹ thuật xác định kháng nguyên biệt hoá (CD) là phân loại leukemia và nghiên cứu tình trạng bệnh lý có liên quan đến rối loạn miễn dịch. Dựa trên nguyên lý kỹ thuật miễn dịch
đánh đấu: ding một chất đánh đấu (chất màu huỳnh quang, chất phóng xạ hay men...) gắn vào kháng nguyên hoặc khẳng thể để phát hiện ra kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng ở mức vi thể (tổ chức, tế bào...) hoặc định lượng chất đó ở mức vi lượng. Kỹ thuật xác định kháng nguyên biệt hoá dùng chất màu huỳnh quang để đánh đấu nên còn gọi là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.
2. Dụng cụ, hoá chất
Ở đây, chúng tôi trình bày kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (MDHQTT), một kỹ thuật phổ biến hiện nay ứng dụng trong phân loại leukemia và xác định tình trạng miễn dịch của cơ thể trong một số bệnh lý.
— Kính biển vi huỳnh quang
— Máy ly tâm lạnh
— Máy đếm tế bào (đếm số lượng bạch cầu )
— Ống nghiệm
~ Lamen, lam kính
—_ Các loại kháng thể kháng CD - tuỳ theo mục đích nghiên cứu
Các loại hoá chất khác: Dung dich ficoll-Isopaque 1,060, dung dich pha hồng c: cầu, dung dịch cố định tế bào, dung dịch đệm PBS, bộ kit chứng...
`3. Quy trình kỹ thuật
3.1. Quy trình kỹ thuật MDHQGTT phân loại leukemia
3.1.1. Kỹ thuật phân lập tế bào blast trong mẫu nghiệm tuỷ xương
—_ Điều chỉnh số lượng tế bào có nhân trong dịch hút tuỷ xương ở mật độ 10 -
15 x 109/1
—ơ Chuẩn bị dung dịch ficoll-Isopaque 1.060, đặt 2 ml ủeoll vào đỏy ống nghiệm 10 x 100mm.
— Đặt nhẹ nhàng 4 ml huyền dịch tế bào lờn bề mặt lớp ủcoll, trỏnh trộn lẫn giữa hai lớp.
— Ly tâm 9200 vòng x 90 phút ở 16°C, hút bỏ dịch nổi
— Thu hoạch lớp tế bào màu trắng dục ở giữa, rửa 3 lần trong đệm PBS
~ Kiểm tra tỷ lệ tế bào sống chết bằng xanh trypan 0,1%: tế bào chết sẽ bị nhuộm xanh trypan trong nguyên sinh chất. Đảm bảo tỷ lệ tế bào sống trên 90%.
Có thể kiểm tra tỷ lệ tế bào blast bằng cách huyền dich lại với huyết tương của chính bệnh nhân và đàn tiêu bản, nhuộm Giemsa và đọc tiêu bản. Tiến hành xét nghiệm MDHQTT ngay sau khi tách. Nếu tỷ lệ blast tuỷ xương cao > 90% tế bào có nhân thì không cần tách blast.
3.1.2. Kỹ thuật MDHQTT
~ Điều chỉnh huyền dịch tế bào ở mật độ ð - 10 x 10%, lắc đều
— Trong các ống nghiệm sạch, kích thước 10 x 100 mm, đánh dấu mẫu nghiệm, đặt nhẹ nhàng 0,1m] huyền dịch tế bào xuống đáy ống, tránh đính mẫu nghiệm lên thành ống. Đặt tiếp 0,02m] dung dịch anti-CD tương ứng vào đáy ống, trộn đều.
~_ Ủ trong tối ở nhiệt độ phòng thời gian 30 - 45 phút, cữ 10 phút lại lắc đểu 1 lần.
— Phá hồng cầu bằng dung dịch phá hồng cầu, trong 7 - 10 phút đến khi màu của huyền dịch trong suốt là được.
— Rửa bang dung dich PBS: ly tam 1500 vòng x 1õ - 20 phut 6 25 - 25°C, hut bỏ dịch nổi. Rửa liên tiếp 3 lần.
~ Cố định cặn tế bào còn lại bằng dung dịch cố định (0,05m), bảo quản trong tối ở nhiệt độ 2 - 6°C đến khi đọc kết quả (trong vòng 24 giờ).
- Doc kết quả trên kính hiển vi huỳnh quang, bước sóng 450-492nm, vat kính 40:
Anti-CD gắn FITC (CD3, CD10): màu xanh lục
Anti-CD gắn PE (CD5 hoặc CD7, CD14, CD19, CD16/66, CD33, CD34):
màu vàng cam.
Các kit chứng đểu gắn cả FITC lẫn PE. Đọc chứng âm, xác định nền tế
bào âm tính. Đánh giá tỷ lệ % blast dương tính.
3.2. Quy trình kỹ thuật MDHQTT trong nghiên cứu phân bố tế bào miễn dịch
~ Đếm số lượng tế bào có nhân trong mẫu nghiên cứu (máu hoặc dịch hút tuỷ xương) bằng máy đếm tế bào. Điều chỉnh mật độ tế bào ở mức 5 - 10 x 10/1.
— Trong các ống nghiệm sạch kích thước 7x10mm, đánh dấu mẫu nghiên cứu, đặt 0,1ml huyển dịch tế bào xuống đáy ống nghiệm (tránh dính lên thành ống), sau đó đặt tiếp 0,02m] anti-CD tương ứng, trộn đều nhẹ nhàng.
— Các bước tiến hành tiếp theo như kỹ thuật MDHQTT phân loại leukemia.
4. Nhận định kết quả
- Chứng âm: để xác định tình trạng gắn huỳnh quang không đặc hiệu và tình trạng tự phát quang của tế bào.
— Đọc kết quả, đếm từ 200 tế bào có nhân trở lên, tính tỷ lệ phần trăm tế bào phát quang trên số tế bào có nhân. Các tế bào sẽ phát màu xanh lục (chất màu huỳnh quang FITC) (CD8, CD4) và màu vàng cam (chất màu huỳnh quang PE) (CD 8, CD16/56, CD34).
— Tính số lượng tuyệt đối: nhân tỷ lệ tế bào phát quang từng loại với số lượng tuyệt đối tế bào có nhân (đếm trên máy đếm tế bào).
5. Các yếu tố ảnh hưởng
— Đếm số lượng tế bào có nhân không chính xác
Quá ít tế bào
— Phát quang giả 6. Ghi chú
Ky thuật MDHG là kỹ thuật nhanh nhằm phát hiện kháng nguyên đặc hiệu trên bể mặt tế bào hoặc tổ chức cắt. Phương pháp này bao gồm 4 kỹ thuật:
MDHQTT dùng KT đặc hiệu gắn HQ; MDHQGT dùng anti-y-globulin gắn huỳnh quang phát hiện KT đặc hiệu; MDHQTT khuyếch đại bằng bổ thể; MDHQ phân tích qua đồng chảy tế bào (FAGS) (hình 5.9 và 5.10)
Trực tiếp. Gián tiếp Gian tiếp có bể thể Kháng thể gắn" huỳnh quang Kháng thể phản ứng với KN bé mat Kháng thể phản ứng với KN bề mặt
Bề mặt tể chức cắt
ET†————- Bẻ mặt lộ chức
(A) huỳnh quang Anti Ig gan Bổ sung bổ thể
L-8m2ô8z|—~ Sỏt sonkei te)
Rửa
Bì ®) €; gin huỳnh quang Kháng thể đặc hiệu
| ——* Phản ứng MDHQ gần bổ thể
Fxr[——* Tổ chức
(c) Hình 5.9: Mô hình phản ứng miễn dịch huỳnh quang phát hiện KN bề mặt tế bào và tổ chức
A: Mô hình MDHG trực tiếp: Dùng kít kháng thể gắn huỳnh quang ủ trực tiếp với tế bào đích hoặc tổ chức đích.
B: Mô hình MDHQ gián tiếp: Sử dụng. anti-y-globulin miễn dịch (anti-Immunoglobulin) gắn huỳnh quang phát hiện kháng thể typ lgG đã phản ứng đặc hiệu với KN tế bảo đích.
C: MDHQ gián tiếp khuyếch đại bằng bổ thể hoại hoá: : Đây là hẳn ứng làm tăng độ nhạy của kháng thể cố định bổ thể. Phản ứng KN+KT với sự có mặt của bổ thể, thể bị hoạt hoá, tạo nhiều thành phần Cab.
C3b gắn vào phan Fc cia IgG và trực tiếp hấp phụ trên bề mặt tế bao dich. Sau đó, kháng bổ thể đặc hiệu C3b gắn huỳnh quang được bổ Sung, phan ứng ) sẽ xuất hiện ở nhiều vị trí có gắn bổ thể trên bề mặt tế bào đích. Nhờ vậy phản ứng khuyếch đại bổ thể làm tăng độ nhạy của MDHQGT,
216
Mẫu nghiệm
[min H
|
laser
ệ thống rung
Huỳnh quang
mau dé (-)
Bộ phận tách Huỳnh quang màu xanh (+)
Ánh sáng chiếu thẳng 90”
Tia sing phântích cáchatnhỏ
Đĩa lỡ ia
di dang OF „ @ trải rộng
san is
Lympho chung Nhóm CD8+ của mẫu nghiệm
n
Hình 5.10: Mô hình MDHQ sử dụng máy FACS (Fluorescence — activated — cell — sorter)
- Đưa vào buồng đếm tế bào dịch tế bào đã nhuộm với kháng thể huỳnh quang - Nhờ có hệ thống “rung” tế bào tách ra và chuyển động theo dòng chảy
- Dòng chảy tế bào chạy qua bộ phận phân tích bằng tia laser, ở đây mỗi tế bào được tách riêng, được đo kích thước (size), các hạt nhỏ được xác định, màu xanh huỳnh quang (+) và màu đỏ (-) được xác định và ghi trên băng giấy.
- Nhờ hệ thống rung, dịch tế bào lại được tách ra từng giọt, mỗi giọt là 1 tế bào. Các giọt tế bào. này chạy qua đĩa lõm đổi dạng, hai nhóm tế bào (+) và (-) được thu hoạch vào ống nghiệm, hệ thống máy được rửa lại, tiếp tục kiểm tra mẫu khác.
- Trên cơ sở 3 chỉ tiêu thu được: kích thước tế bào (s), số lượng tế bào (n) và màu huỳnh quang () tính ra được số tế bào tham gia phản ứng.
217