Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh năm 1980 nhờ các thành tựu:
1. Phát hiện men tổng hợp ADN (ADN polymerase) có đặc điểm: tổng hợp tiếp tục đoạn ADN đang “dang đở” trên khuôn có sẵn.
2. Biết được trình tự các nucleotid ở nhiều đoạn gen người. Tổng hợp được một đoạn ADN bằng phương pháp hoá học (oHgo polynueleotid) làm mổi (primer).
3. Ứng dụng tính chất bổ sung của sợi kép ADN và có thể cắt các liên kết hydro giữa hai sợi bằng nhiệt độ cao.
1. Nguyên lý
Người ta dùng nhiệt làm biến tính hai sợi của chuỗi xoắn kép ADN cho chúng tách ra, tạo nên bai sợi tự do có khả năng gắn với đoạn ADN có trình tự base nitd bổ sung, sau đó lấy đoạn mổi (primer) là đoạn ADN ngắn cho gắn vào
ADN phân lập được ở vùng có trình tự bazơ nitơ tương đồng, rồi điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzym (với sự có mặt của các nueleotid hoạt hoá, đoạn mỗi đã gắn lên ADN khuôn thì ở nhiệt độ thích hợp ADN polymerase sẽ tổng hợp tiếp ADN). Bằng nhiều lần như vậy, người ta đã tổng hợp được khối lượng lớn ADN trên khuôn có sẵn.
Để nhân lên một đoạn gen, người ta dùng hai mổi (cặp mổi) có trình tự nueleotid tương ứng với hai đầu của đoạn gen này.
Vì quá trình tổng hợp ADN luôn luôn được tiến hành theo chiều từ đầu ð' đến đầu 3, và với 2 mỗi có trình tự nucleotid bổ trợ cho 2 sợi ADN ở 2 đầu (phía 3' của mỗi sợi), thì ở chu kỳ một sẽ tao được 2 đoạn ADN mới dài hơn đoạn cần tìm nhưng mỗi đoạn có một đầu (đầu 5) bị giới hạn bởi mổi. Đến chu kỳ 2 sẽ tạo được
2 đoạn ADN có giới hạn hai đầu ở vị trí mà mổi “gắn” (Hình 3.6).
Sait '
Chuỗi xoẩn ADM
sạ2 3 s
= [HƯU MSI (Primer)
# CHHE—————————W##— 3 woe ov
ằ Chu ky 4
9 OS ý
So 2b 8 <9 3
Site 2? Eẽọs
Sa tc ¢ <3
Dung Chu kj 2
Soi 2b
Sgi2e
Sgfe
Chu kỳ 3
Seize
Hình 3.8: Sơ đồ phản ứng PCR tổng hợp đoạn ADN từ A — B
133
Nguyên lý hoạt động của máy PCR:
Thực chất của PCR là phản ứng enzym trong ống nghiệm dưới tác dụng của nhiệt. Máy PCR là máy điều khiển nhiệt độ theo chương trình để đảm bảo ba chế độ nhiệt:
— Nhiét dé 94 - 95°C dé tách sợi ADN kép ra hai sợi ADN đơn
— Nhiệt độ 30- 6B°C (tuỳ theo yêu cầu của đoạn mổểi và tính chất của đoạn gen) có tác dụng “gắn” mổi vào vị trí có trình tự base nitơ tương đồng của đoạn
gen (ADN).
— Nhiệt độ 70-73°0 đảm bảo hoạt động tốt cho enzym tổng hợp ADN tiếp từ đoạn mỗi.
Do đặc điểm của men taq ADN polymerase có thể chịu nhiệt và mất tác dụng sau một thời gian nên ngươi ta thiết kế các máy có thời gian thay đổi nhiệt độ giữa các chế độ càng ngắn càng tốt
2. Hoá chất, dụng cụ
1. ADN khuôn: từ tách chiết ADN
2. ADN mỗi (primer) và các dung dịch đi kèm 3. DNTP (desoxy ribonueleotid hoạt hoá) 4. Enzym (taq ADN polymerase)
5. May PCR, may và dụng cụ hoá chất điện di Máy và các dụng cy chup anh UV, micropipette
3. Tiến hành kỹ thuật 1. Trong ống Eppendorf
— Pha hỗn hợp dung môi và mỗi - Trén méi, men, nucleotid
— ADN khuôn
—_ Cho đầu paraphin nếu cần (tuỳ từng loại máy, nếu có bộ phận chống mất hơi nước có thể không cần đầu).
2. Chuẩn bị chương trình nhiệt cho máy
3. Để máy chạy theo chương trình đã đặt, thời gian khoảng 30 phút
Thông thường một chu kỳ khoảng 1 phút, sau khoảng 30 phút thì men hoạt động kém và lượng ADN cũng đã nhiều. Từ 1 ADN ban đầu sau khi chạy sẽ có 2"
sợi, n là số chu kỳ.
4. Sau khi máy ngừng chạy, để về nhiệt độ 10°C
— Lấy ra hút bỏ dầu trên (nếu có)
- Trong éng Eppendorf cho:
+ 8l địch ADN vừa tổng hợp +2 Hl thuốc nhuộm
Trộn đều và cho chạy điện đi trên gel với dòng điện 80 V, 45 mA, thời gian khoảng 4ð phút. Nhuộm, soi và chụp UV sẽ thấy rõ 1 vạch (nếu dùng một cặp mỗi).
4. Các yếu tố ảnh hưởng
PCR là phản ứng rất nhạy, dễ dương tính giả nếu để lẫn ADN ngoại lai, nên mọi thao tác ở các bước phải vô trùng và người ta thường chạy thêm một chứng âm (không cho ADN khuôn).
5. Các ứng dụng của PCR
~ Dùng để nhân lên ADN sau đó lai, phát hiện bằng mẫu đò đặc hiệu
~ Dùng cặp mỗi đặc hiệu, có thể 2 hoặc 3 mỗi để phát hiện các đột biến hay tính đặc trưng ADN cho loài, cá thể...
Chuong 4