4.2.1. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ NHỚT
Phương pháp này thường dùng khi cơ chất của enzim có độ nhớt lớn hơn sản phẩm thuỷ phân của nó. Sự biến đổi độ nhớt của sản phấrn ứng trước và sau khi cho enzim tác dụng là thước đo hoạt động enzim. Phương pháp này thường đế đo h oạ t đ ộ n g c ủ a enziĩTi a m i l a z a , pr oi ei na za , p e ct i naz a, x e n l u l a z a v.v.
4.2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN c ự c KẾ
Phương pháp này thường dùng khi cơ chất của enzim hay san phẩm phân giải của nó có khả năng làm thay đổi mặt phảng ánh sáng phân cực và góc quay riêng của chúng khác nhau. Người ía thường dừng phương pháp này dể xác định hoạt dộ của [3-fructofusanosidaza (saccaraza). Cơ chât cúa enzim là sacaroza có góc quay riêng là -f66‘’5, sản phấm tliiiỷ phân của nó là glucoza và íVuctoza có góc quay riêng lương ứng là +32*’5 và -92“5. K hi enzim tác dụng lên saccarozii, góc quay nghiêng giảm dần và cuối cùng chuyển từ phái sang trái.
4.2.3. PHƯƠNG PHÁP ÁP KỂ
Phương pháp này được dùng khi enzim tác dụng tạo thành hay hấp thụ khí.
V í dụ: các phản ứng oxy hoá, decacboxit hoá, loại amin v.v. Ngoài ra có thể dùng
p h ư ơ n g p h á p n à y d ể x á c đ ị n h h o ạ t đ ộ c ủ a c á c e i i z i m m à i r o n g q u á I r ì n h p h á n Lhig
không trực tiếp làm biến đổi những thể tích khí nhưiig thông qua những phản ímg trung gian tiếp theo có thể lạo thành hay hấp thự khí.
\ dụ: Phản ihig tạo thành axil do men lipaza xúc lác có thể dùng dung dịch đệm bicacbonal đế tạo thành CO2 hoặc các phán ứng lạo thành nhóm amin tự do dưới tác dụng của peptid-hydroxylaza hoả, phán ứng có thê tác dung với axit nitơ và lạo thành khí nitơ (phương pháp Vanslke). Đế đo sự biến dối thế lích khí thường tiến hành phản ứiìg trong máy Varburg.
4.2.4. PHƯƠNG PHÁP P H ổ QUANG KẾ
Phương pháp này cần lượng nguyên liệu nghiên cứu rất lì, có độ nhạy cao, cho phép xác định chính xác, nhanh chóng hoại độ của enzim. Vì vậy phương pháp này được dùng rộng rãi nhấi trong nghiên cứu enzim. Trong irirờng hợp phán ứng e n z i m k h ô n g l à m b iế n đối rõ vết q u a n g p h ổ h ấ p p hụ cQng c ó t h ể s ử d ụ n g phưcmg pháp phố quang kế bàng cách cho ihêm vào hỏn hợp phản ứng một enzim khác có tác dụng lên sản phẩm phản ứiig dế làm iliay đổi sự hấp phụ.
4.2.5. PHƯƠNG PHÁP CHUẨN đ ộ l iê n t ụ c
Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu các phản img enzini mà kêì quà của nó tạo ihành axit hoạc bazơ. Dùng thiết bị lự động thêm kiểm hay axil vào để giữ pH m ôi trường phản ứng cố định, dồng thời ghi đường cong biểu cliẻn lượng kiềm hay axit đã dùng. Tốc độ thêm kiềm hi\y axit đà dùng vào hỗn hợp phản ứiig phản ánh tốc độ phản ứng enzim. Phương pháp này còn có thể dùng nghiên cứu các oxydoreduciazii bằng cách đo thế oxy hoá khử.
4.2.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
Phương pháp sắc ký trên giấy thường đùng để xác định hoạt độ các enzim phân giải hoặc chuyển hoá các axit amin (gluiam ai cacbonxylaza. alamin aminolransferaza...). Sau khi cho enzim tác dụng với cơ chất một ihời gian, lấy mộl
ít hỗn hợp pliản inig chấm lên giấy sắc ký \’à tiến hành sãc ký theo phương pháp thông thường, hoặc cho hồn hợp lẽn ináy axit amin tự động. Kết qua dịnh tính và định lirợng axit am iii còn lại hay mới lạo ihành trong phan ứng cho phép xác dịnh lioạt dộ của enzim. Phương pháp sắc ký đòi liò i thời gian dài hơn (vài giờ nhưng có lliế cho kết quả cụ thể tẽn \'à lirợng của các sản phấm được lạo thành, \'ì vậy thường được clùiig trong nghiên cứu enzim).
4.2.7. PHƯƠNG PHÁP HOÁ HỌC
Phương pháp Iiày Uiường dìing các phan ứng hoá học khác Iihau đế dịnh lircíng các chất bị mất di hay tạo thành trong dung dịch dưới tác dụng của enzim.
Các phản únig được tạo thành thường là các phán ứng màu đặc trưng như phản ứng biiire, phản ứng với thuốc thử fo lin của protein. Ngoài ra có thể dùng các phản ímg kliống đặc tiamg như phản ứng của đường khử với thuốc thứ íelling, phán ứng của axit \’ới bazơ.
Nhìn chung đế xác đ ịiih hoạt dộng cúa một enzim nào đó thường sử dụiig một trong các phương pháp kể trẽn, theo dõi hoặc xác định sự biến đối lượng cơ chất lioặc sản phám phản ứng sau klioảng thời gian xác dịnh dưới tác dụng inột lượng enzim nhất định. Tuy nhiên trong một số trườiig liợp cũng có thể tiến hành theo cách khác; ví dụ xác d ịn li thời gian cần ihiêì để tạo nôn mộl sự biến đối xác định cỉia cơ cliấi hoặc sàn phẩm phán i'mg dưới tác dụiig ciia một lượng enziin nhất định, hoặc ngược lại giữ tliờ i gian phản ứng cổ' dinh chọn nồng clộ enzim cần thiết để thu được một sự biến đổi xác clịiih của cơ chất hoặc sản phẩm phản ứiig. Tuỳ theo yêu cầu và diều kiện thí nghiệm cần lựa chọn phương pháp thích hợp và sử dụng IIÓ liợp lý ciể xác clịnh hoạt độ enzirn.
Mírc độ hoạt động của enzim trong một chế phẩm là một thông tin quan trọng về lượng enzim trong đối iưựiig nghiên cứu, vì ràng trong những điều kiện nhất định, tốc độ phản lìmg do eiizim xúc tác tỷ lệ với lượng enzim có trong hỗn hợp phản ứng. Lượng eiư im ở đây không tính bằng mol hay m iligam mà dược biểu diễn bằng dơn vị hoạt độ enzim (U). Theo quy ước quốc tế, đơn vị tiêu chuẩn của enzim
là lượng enzim có khả năng xúc tác chuyển hoá một m icrom ol cơ chất sau 1 phút ở những điều kiện xác định cho trước.
ITiông thường tiến hành xác định hoạt độ ở 30"c, với pH và nồng độ cơ chất thích hợp đổi với từng loại enzim nghiên ciru.
Clìú ý:
a. Trong trường hợp enzim phân giải mộl số liên kết của phân tử cơ chất, ví dụ proteinaza, amilaza với cơ chất linh bột thì đơn vị tiêu chuẩn của enzim không tính theo m icrom ol cơ chất bị chuyển hoá mà tính bằng m icrom ol đương lượng của các nhóm tương ứng được tạo thành. Nói cách khác là không tính theo lirợng cơ chất bị chuyển hoá mà tính theo số liên kết (peptit hoặc glucozil) bị phân giải.
b. Trong trường hợp phản ứng giữa hai phân tử theo kiểu A + B = c + D, thì đơn vị enzim xúc tác chuyển hoá 1 micromol cơ chất A hoặc một m icrom ol cơ chất B, hoặc 2 m icrom ol cơ chất A (hoặc B) nếu A = B sau một phút.
c. K h i xác định hoạt độ enzim trong dịch ihể thì tính đơn vị enzim trên lOOOml dịch thể.
d. Có thể dùng các ước và bội số thập phân của đơn vị để biểu diễn hoạt độ của enzim, ví dụ m ili đơn vị (m ư ), k ilo đơn vị (kU).
Nhờ có quy lắc thống nhất về đơn vị enzim mà ta có thể so sánh hoạt độ của các enzim khác nhau hoặc các chế phẩm khác nhau của cùng một enzim. Đ ố i với m ỗi chế phẩm enzim, ngoài việc xác định mức độ hoạt động của nó cần phải đánh giá độ sạch của chế phẩm. Hoạt lực riêng là đơn vị đặc trưng cho độ sạch của enzim. Hoạt lực riêng đều đánh giá hay biểu diễn bằng số đơn vị enzim irên Im g protein. Ngoài ra nếu biết chính xác trọng lượng phân tử của enzim có thể lính được hoạt độ phân tử của nó. Hoạt độ phân tử của enzim là số phàn tử cơ chất (hoặc số đircmg lượng của nhóm tương ứng) bị chuyển hoá dưới tác dụng một phân tử enzim sau một phút. Nếu biết được số trung tâm hoạt động độ trung tâm xúc lác. Nó là phân lử cơ chấi bị chuyển hoá sau một phút tính trên một trung tâm xúc tác. Nếu phân tử enzim chỉ có một trung tâm xúc tác thì đại lượng này irùng với hoạt độ phân tử enzim.
Nồng độ enzim trong dung dịch thường được bicu diễn băng số dơn vị hoạt động trên ỉm l dung dịch.
4.2.8. NHỬNG ĐỈỀU Lưu Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZIM
Bản chất hoá học của enzim là protein nên enzim không bền vừng rất nhạy cảm với lác nhân lý hoá học. Vì vậy khi làm thí nghiệm \'ới enzim cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein như nhiệt độ cao, pH quá axii hay kiềm, các kim loại nạng hay muối của chúng. Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong dung dịch V ỉ m ội số enzim có thể bị kìm hãm trên bể inặl phàn cách. Để đảm bảo chính xác hoạt động enzim cần bảo đảm các điều kiện sau;
a. Các diều kiện ỊD hản ứng (pH, nhiệt độ) phải ờ Irong giới hạn enzim có thể tồn tại bền vữiig và được giữ cố định trong suốt thời gian phản ứng trong dung dịch đệm với pH xác định, binh hỗn hợp phản ứng đặt trong máy siêu ổn nhiệt. Dung dịch cơ chất và enzim phải đạl đến nhiệt độ cần thiết trước khi cho vào phản ứng.
Đối với các phản ứng lạo thành axit cẩn ước lượng dung dịch đệm ihế nào đế cho pH không bị thay đối nhiều.
b. Phản ứng enzim được tiến hành trong điều kiện thừa cơ chất và coíactơ (nếu enzim cần thiết coíactơ). Cần tính trước lượng cơ chất thế nào dể sau khi kêì thúc phản ứng, cơ chất bị chuyển hoá không quá 2 0% lượng bán đầu. tuy nhiên cũng cần chú ý rằng nồng độ cơ chất hay cofactơ quá lớn có thể kìm hàm enzim.
Để xác dịnh nồng độ thích hợp cho phản ứng enzim có thể làm như sau: Xác dịnh tốc độ phản ứng với 1 nồng độ enzim xác định, sau đó tăng lượng enzim lên gấp đôi, nếu tốc độ phản ứng cũng lăng lên gấp hai lần có nghĩa là nồng độ cơ chất đã thích hợp và nồng độ phản ímg chi phụ thuộc vào lượng enzim. Kết quả xác định hoạt độ phản ánh đúng hoạt động xúc tác thực của enzim.
c. Thời gian xác định hoạt dộ thường không quá lâu, thường là 5-30phiíl, lốt nhất là xác định tốc độ ban đầu của phản ứng (30-60 giảy) vì ở thời gian đầu phản ứng tốc độ iưưng đối ổn định sau đó bắt đầu giảm. Điều này do nhiều nguyên nhàn khác nhau như do sự giảm nồng độ cơ chất, do tác dụng kìm hãm của các sản phấm được tạo thành hoặc do enzim bị phá huỷ trong quá trình phản ứiig.
Trong một số trường hợp, hoạt độ của enzim quá thấp có thể kéo dài thời gian ủ enzim lên đến 1 giờ hoậc lâu hơn nữa.
K lii xác d ịiih hoạt độ enzim bên cạnh mảii thí nghiệm (enzim tác dụng với cơ chất) cần làm mẫu kiểm Ira. trong đó enzim đã bị mất hoạt dộng trước k h i tiếp xúc với cơ chất, bàng cách đun sôi dung dịch enzim trước khi cho vào hỏn hợp phàn i'mg. Hoạt độ cũa enzim được tính bằng hiệu sỏ' lượng cơ chất hoặc lượng sản phám phản ứng... giữa mầu thí nghiệm và kiểm tra.
4.2.9. CHUẨN BỊ DUNG DỊCH ENZIM ĐỂ x á c đ ịn h h o ạ t đ ộ x ú c t á c
Dung dịch enzim cần được loại hết tế bào vi sinh vậy hay cơ chất nuôi cấy nó, chứa nó thường có hai loại:
Enzim ngoại bào: nếu vi sinh vật nuôi trong m ôi trường lỏng, sau khi nuôi cấy ly tâm lạnh môi trường ở 500-600 vòng/phút để nhận được dung dịch trong suốt.
Nếu vi sinh vật nuôi bằng phương pháp bề mặt sau khi nuôi cấy, cân 10-20g môi trường, chiết rút bằng dung dịch đệm tương ứng pH xác định dê enzim có tliê tồn tại bền vững. Lượng dung dịch đệm dùng để chiết rút gấp 10-20 lần đối trọng (khoảng 200ml). Lọc dịch nhận được qua giấy lọc xếp được ly tâm để nhận được dung dịch trong suốt.
Enzim nội bào: Trước hết cần phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Để phá vỡ màng tế bào có thế dùng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp cơ học dùng siêu âm hoặc dùng enzim. Tuy nhiên cần chọn phương pháp thích hợp sao cho không ảnh hưởng đến hoạt động của enzim nghiên cứu. Tiếp theo chiết n it và lọc để nhận được dung dịch trong suốt.