iI_ _ _
1 1 . 6 . 2 . 1 . P h á n t í c h a f l a t o x i n
Thực phẩm c ó thể bị nhiễm nhiều loại độc tố aAatoxin như các aAatoxin B l, B2, G l , G 2. C húng c ó nguồn gốc từ nấm sợi và có trong cá c thực phấm bị nhiễm
tạp trực tiếp, nghĩa là chủ yếu c ó Irong các thực phẩm c ó n gu ồn g ố c thực \'ật. Trong thực phẩm c ó Iigiiốn g ố c dộng vật mà đặc biệl là các sán phấm từ sữa Iihiềrn tạp ihứ cấp do vậl chủ ãn phải thức ăn có chứa a íla lo x in . cầĩi phái kể đến a íla to x in M l.
T h eo quy định của Pháp, hàm lượng aflato,xin BI là ih ôn g s ố duy Iiliãt cán xem xét khi dánh giá độc tính của thực phám, trong khi đó pháp c h ế cúa M ỹ lại quy định hàm lượng aflatoxin nhiẻm tạp phải là tổn g hàm lượng của a n a to x in B l , B 2, GI và G 2.
u. Clniđii b ị m ầu
D un g d ịch a íla to x in loãng kém bền, nó bị phán hiiỷ dưới tác d ộ n g của ánh sáng nên cần được pha mới thường xu yên. N g o à i ra a fla to x in cò n là chất gây ung thư m ạnh nên thao tác phải được tiến hành cẩn thận và tuân thủ c á c n g u y ên tắc. Pha dung dịch aflatoxin trong b enzen-axetonitril (9 0 + 10), đạt n ồn g độ 10p.g/m l.
b. Phiừtng p h á p nliaiìlì sử dụng c ộ t nlicSi â p dụng ch o sân p h ẩ m run q u ủ
C ó nhiều phương pháp định phân a ílatoxin . Đáy là phương pháp với các lai điểm nhanh, đơn giản , kinh tế, c ó khả nãng áp dụng trên hầu hết các n gu yên liệu và ch o phép phân tích định tính bước đầu, nliưiig không thể áp dụ ng trong trường hợp mẫu phân tícli c ó chứa chlorophyl.
c. Phương p lú ip s ắ c ký bcỉit lìiỏiig - Plìươiìg p h á p C E E ( rcni q itả )
V ới những sán phẩm “đơn g iả n ” thì việc phân tích sử d ụ n g sắc ký đơn chiều cũng đủ c h o kết quả đáng tin cậy. Song dối với m ộl s ố sản phẩm c ó cluíra các chất c ó khả năng làm rối loạn quá trìiih phân tích (ví dụ cá c d ạn g thực phẩm từ gia súc có chứa c h lo ro Ị)h yl) ih ì cần có sự can thiệp của sắc ký bản m ỏng 2 chiều.
d. Phương p h á p IIP L C
M ẫu phân tích được chiết, lọc, pha loãng và c h o di qua cột ái lựr m iền nhiẻm c ó chứa kháng thể dơn dòng. K háng thể dơn dòng này đặc hiệu với các đ ộc tô' aA atoxin B l , B 2, G l , G 2. Đ ộ c tố dược tách, làm sạ ch , làm giàu trên cộ t, sau đó được tách khỏi cộ t bàng m etanol. Đ ộ c tố aflaioxin tổn g sô' được x á c định bằng m áy đo huỳnh quang sau khi đã clio phản ứng với dung ciịch brom (plurơng phá|) SFB).
Các a íla to x in riên g biệt được xác định bằng phương pháp sắc ký lò n g hiệu năiig cao với pliủn lìnig iod sau cột (pliirưng pháp PCD).
F ipoxy-tricotecen là các độc tố gây ra bởi các loài iliLiộc chi Fiisariiifìì, S íacliỵhotrvs và nhiều chủ n g nấm m ốc khác. C'hĩmg Ihirừng đươc tìm thấv trong ngũ cốc mà đặc biệt là trona ngô. Hiện tượng nhiễm dộc g a y ra bới các độc tố này tươnií dối n g h iêm trọng do con người rất nhạy cảm \'ới d ộ c tính cùa cliiìiig: cỉộc tô' nhóm này là cá c tác nhân A T A (A leu cie T oxiqu e A lim entairc), cá c 'ác nhân làm suy giàin khả năng m iễn dịch g â y ra hiện tượng suy giám bạch cầu.
Các phương pháp phân tích hiện c ó đều dựa trên k v thuật sác ký k hí-lóng.
D eso x y n iv a len o l (v o m ito x in ) là độc tố duy nhất có thế xá c định bằng sắc ký bán m ỏng.
a. C á c test sinh h ọ c
- Úc c h ế quá trình sinh trưởng của ỉym ph om cytes tnuriiis in vitro: ch o biết kết quả sau 4 8 h và đo trực tiếp được khả năng su y giảm m iễn d ịch cùa d ịch ch iết phân tích.
- Đ ặ c tính hoại da: chất chuẩn được chọn có thế là đ ộc tố T -2. Đ ộ n g vật sử dụ ng trong thí ngh iệm c ó thể là chuột do phản ứiig của chú n g với đ ộc tố tươpg đối ổn định
b. K ỹ thuật R O M E R , B O L Ỉ N G vù M c D O N A L D
Phương pháp này sử dụng kỹ thuật sắc ký khí-lỏng, với cá c m ầu nhiễm độc ở mức thấp m uốn xác định cần phải sử dụng thêm một detector c ộ n g kết điện tỉr.
Với detector c ộ n g kết điện tử, c ó thể phái hiện ở mức 100 ppm với T -2 và 25 ppm với d ia x eto x y scirp en o l, c ó thể tăng độ nhạy hơn nữa trong Irường hợp cần thiết. Với detector ion hóa ngọn lửa không vượt quá Iigưững 250 ppin dối với T-2 và 150 ppm với d ia x eto x y scirp en o l. N gư ỡng phát hiện này có áp dụng được trong k iểm tra thức ăn gia siic s o r g không thể áp dụng với thức ăn cho người.
c. Phân tích deoxxiiÌYuleiioí ( D O N )
Phương pháp dựa trên việc xác dịnh các vết huỳnh quang trên sắc ký bản m ỏn g tạo ra bởi các dẫn xuất từ phản ứng giữa DON và N H4CI ở 120"C. G iới hạn xác định củ a phương pháp là 100 n g/g (hay 100 ppb).
I I . 6.2.2. Phán tích epoxy-tricotecen
11.6.2.3. Phân tích learalenon
Z caralenon là đ ộ c tô' c ó hoạt tính oestrogen k h ôn g m on g inuốii, nó thường nhiễm vào ngũ c ố c inà đặc biệt là n g ô với hàm lượng đ ô i khi lất lớn. Phương pháp m ô tả dưới đáy c h o phép đạl m ức tối ưu giữa hai tiêu chí: "dộ cliíiih xác củ a phép địnli phân/
c ó thể tiến m g/k g hay
.nức dộ d a n giản-jýài-4p d ụ Ạ f e ’V C Q £ ^ d Q ạ g pháp hành trên T L C hay trên HPLC. G iới hạn dirới của phương phẩp là 0,01 10 ppb khi sử dụng H PLC và 0 ,0 2 m g /k g hay 2 0 ppb với TLC.
ỉ 1 . 6 2 . 4 . C á c p h ư ơ n g p h á p m i ễ n d ị c h h ọ c
Troi g r ố cá c phương pháp h óa-m iễn d ịch , phương pháp m iễn dịch ịphóng xạ hay radio- m m u n o -a ssa y (R IA ), phương pháp en zy m h ọ c m iễn d ịch h a y ie n z y m e - lin ked-im rL uno-sorb ent-assay (E L IS A ) và ái lực m iễn nhiễm (im m im o affin ity) đirợc sử d ụ o g trong định phân đ ộc tò' vi nấm.
Hai phương pháp R IA và E L ISA dưa trên sự cạn h tranh liên kết gili'a độc tố chưa biết (Ịua mảu phân tích vớ i độc tố đã biết cùa mầu chuẩn trên VỊ trí Ịđặc hiệu cùa kháng |h ể .
Á i lipt m iỗn nh iễm (im m u n o -a ffin ity ) là kỹ thuật sắc ký dựa Irực tiếp trên sự liên kết giĩỊỉt kh áng n g u y ên (đ ộ c tố) với kháng thế dược c ố định trên cột. ■
a. Phương pháp RIA
P h ư ciig pháp này cần c ó sự tiếp xúc đ ổ n g thời giữ a mẫu phân tích Ịhay mẫu chuẩn với ịlàm lượng đ ộ c tô' dã biết k h ông đ ổ i và k h án g thể đặc hiệu. Độcị tỏ' tự do và đ ộc tố
phóng xạ c trẽn đường và hoạt tíi chuẩn.
h. Phương
ìên kết với kh áng thể sau đ ó được phân tách và tiến hành đo hoạt tính ua từng phàn đoạn. N ồ n g đ ộ đ ộc tố củ a m ẫu phân tích được xác clịiih dựa chuẩn x â y dựiig bởi ti lệ giữa hoạt tính p h óng xạ của phân đoạlỊ liên kết ,h p h ón g xạ củ a phân đoạn tự d o với logarit n ồn g đ ộ độr tố củ a mẫu
l á p E L I S A
Phương pháp E L ISA c ó hai dạng;
- V ới kỹ thuật trực tiếp, kháng thể đặc hiệu với hàm lượng xác dịnli đirợc c ố định irên bản sắc ký. D ung dịch m ẫu phân lích và m ột Lrợng đã biết
không đổi của liên hợp “độc tổ -en zy m ” được ủ đ ồ iig thời với nhau. Sau khi lửa, liên hợp đ ộc tố -en zy m giữ lại trên bản sắc ký th ôn g qua kháng thể được tách ra bằng cách sử dụng m ột c ơ chất tạo m àu đặc hiệu với en zym . Đ o cường độ màu bằng m áy hoặc đánh g iá bàng rnắt thường.
- Vótt-kỹ thuật-g iá u ú ép , d ệ e tế é u ợ e c ố đ ịn h irên bản sắ c k ý th ôt^ qua một lìén hợp đ ộ c tố-polypep tit. Sau đ ó dung d ịch m ẫu phân tích và Ểriột lượng xác định k h ô n g đ ổ i kháng thể được ủ đ ổn g thời với nhau. Sau íịôn g đoạn lượng kháng thể gắn kết vào bản sắc ký s ẽ được x á c định t ằ n g cách sử dụng m ột liên hợp en zy m “e n z y m -im m u n o g lo b iilin (kháng thể đặc h iệu )” . C ường độ m àu tạo thành sau khi c h o c ơ chất sin h m àii đặc hiệu yới enzym được đo bằng máy hoặc đánh giá bằng mắt thường. I
c. Sắc kỷ ậ i lực m iễn n h iễm (iiìim iino-affiiiity)-ỈAC
V i (ĩột c ó chứa s ilic hay sắc k ý bản m ỏ n g kết hợp với quan sát duì® đèn ư v , sắc ký lỏiỊg hiệu n ăn g c a o H PLC kết hợp đo cư ờng đ ộ huỳnh qu ang, teật R IA và test ELIS/V. Với các sản phấm rau quả và ngũ c ố c thì cần phải tiến hành iẩông đoạn tách chiếti trước khi ch ạ y lA C . N gư ợ c lại với các chất lỏ n g sin h h ọc tìhir huyết Ihanli, nưcisc.tiểu hay sữa thì hai côn g đoạn tách chiết và tinh c h ế độc tô' từ mẫu phân
tích clirợc ^ến hành d ồn g thời. '
i
I 1Ị .3.TH Ự C HÀNH
l ỉ à t ị 5 . X á c đ ị n h h ù m l ư ợ n g a f l a t o x i n 1
l . ỉíg ity ê ii lắ c
A fl4toxin được ch iế t tìr m ẫu thử bằng các hệ d u n g m ô i hữu c ơ kỊiác nhau.
D ịch c h iế i được lọ c , m ột phần d ịch lọc được làm sạch qua cộ t silicage® (flo risil, SPE). Làii^ bay hơi du ng d ịch rửa g iả i và hòa tan cặn với du ng m ôi pha đ ộn g rồi bơm vào hệ thống sắc k ý lỏ n g hiệu năng ca o (H PL C ).
2 . ỉĩế a ch ấ Ị,th ì(ổ ờ th ở
Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích sắc ký nếu k h ông có các chi dẫn riêng nào khác.
C ác chiián a lla to x in B I . B2, G 1, G2; A xetonitril;
M etanol; T oluen;
H exan; Natri siilíat khan;
C lorofooc; C elit 545;
E te e t y lic ; K hí N2 tinh khiết.
S ilica g e l G -6 0 (hoặc ílo risil) dùng ch o sắc ký c ộ t, c ỡ hạt 0 ,0 6 3 -0 ,2 m m . Hoạt hóa bằng cách sấy khô ở 10íĩ"C trong một g iờ , sau đ ó trút vào bình tam g iá c nút m ài, thêm nước với tỷ lệ Im l nước cho lOOg s ilic a g e l, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đềi', bảo quản 15 g iờ trong bình kín.
Chuẩn bị dung dịch aAatoxiii chuẩn (đ iều k iện tiến hành: trong p h òng mát, tránh ánh sáng): D u n g dịch aflatoxin chuẩn B l , B2, G l , G 2 (d u ng dịch A ) lán lirợt lấy ố n g chuẩn Im g m ỗi loại ch o vào 4 bình định m ức lOOml và định m ức đến vạch hỗn hợp to Ii'en -a x eto n iư il 98:2 (v/v) (n ồn g độ du n g d ịch aA atoxin chuẩn là
10).ig/ml).
D un g d ịch aA atoxin chuẩn làm việc (dung dịch B): C ho vào bình định mức lOml lần lượt 0 ,5 m l aflatoxin B l, 0,5m l aflatoxin G ! , 0 ,l m l a íla to x in B2, 0 ,lm l a íla to x in G 2 (d u n g dịch A ở trên), định mức đến lOm l bằng hỗn hợp toluen- axetonitril 9 8 :2 (v /v ), nồng độ dung dịch là 0 ,5 ụ g /m l đối với B l , GI và 0 ,l|j,g /m l đổi với B 2, G 2.
Cần k iểm tra lại nồn g độ dung dịch a fla lo x in chuẩn (d im g dịch A , X ụ g /m l) bàng quang phố hấp thụ phân tử U V -V IS, bước só n g từ 3 5 0 n m , so với mẫu tráng (to lu en /a x eto n itril), tính kêì quả theo côn g Ihức:
lOOO.m .A X (|.ig/m l) = --- — —
c trong đó :
m - khối lượng phân tử aflatoxin;
A - mật độ quang ớ bước sóng hấp phụ cực đại;
e - đ ộ hấp thụ phân tử của allatoxin.
B ả n g 11.6.3. Độ hấp thụ phân tử của aílatiOxin
Aílatoxin m Dung môi toluen-axetonitril (v/v)
r...
)jrằax (nm)
c (cm mol)
BI 312 98 :2 350 19800
B2 314 98 :2 350 20900
G I 328 98 ;2 350 17100
G2 330 98 :2 350 18200
Bào quản:
Bào quản ở 0"c, dung dịch A để được 6 tháng và đ u n g d ịch B đ ể được hai tuần.
D ụ n g cụ, th iết b ị HPLC với đrìii dò ƯV;
Càn phan tích lO^g;
M áy nghiền;
Cất qiir.y chân không;
M áy ly tâm ; M áy kliLiấy từ ;
lỉơm hút chân không;
Pipei c á c loại;
Pipet Pasteur;
G iấy lọc;
Xvlanh;
Bộ phcii hút chân không.
Cột sắc ký thủy tinh, đường kính trong 22m m , dài 3C)0mm, c ó khóa nút mài thủy tinh hoặc te ílo n và bình đựng dung m ỏi phía trên, dung lích 2 5 0 m l.