5.3. PHƯƠNG PHÁP HOÁ HỌC
5.4.1. SẮC KÝ TRÉN GIẤY
Sắc ký giấy thuộc loại sắc ký phân bố. Chất hấp phụ là giấy xenluloza. Chấm dung dịch phân tích lên các điểm cách bìa tờ giấy sắc ký 1 khoảng. Sau khi cho bay hơi (sấy bằng máy sấy tay, đặt giấy vào máng đimg dung dịch gọi là pha di động.
Các cấu tử trong hỗn hợp sẽ chuyển động theo những tốc độ khác nhau và được tách riêng ra. K h i hiện hình và sấy sẽ xuất hiện thành các vết.
Đặc irimg cho vùng di động là hằng sớ R| là tỉ lệ khoảng cách giữa điểm chấm và khoảng chảy của dung môi. Nếu cố dịnh các diều kiện thí nghiệm thì R đặc trưng cho cấu tạo phân tử của các chất cần xác định. Có thể tiến hành sắc ký xuôi chiều, ngược chiều hoặc sắc ký từ tâm ra. Cũng có thể chia sắc ký một chiều và hai chiều. Cần lựa chọn phương án chạy dung môi thích hợp. Thông thường chạy xuôi chiều.
Hệ thống dung m ôi dùng để tách gluxit:
N ,: Butanol-axit acetic-nước (4:1:5), dùng cho giấy sắc ký N ,, chạy 2 lần (2 ngày)
N,: Pyridin-acetat etyl-nirớc (1:2:2, dùng cho giấy sắc ký N |, chạy 18 giờ đối với m o n o s a c c a r it, hoặc g iấ y N , (c h ạ y 2 -6 Iigày tiiỳ th e o m ứ c đ ộ p o lim e h oá c ủ a các oligosaccarit)
N,: Pyridin-acetat etyl- axit axetic-nirớc (5:5:1:3, dùng cho giấy sắc ký N|
hoặc N,. Các dung môi này tách tốt các monosaccarit và oligosaccarit.
Các hoá chất không đặc hiệu
N,: hoá chất nitrat bạc: sử dụng hai dung dịch liên tiếp:
- Dung dịch A: Im l dung dịch bão hoà nitrat bạc/200ml axetol. Hoà tan kết tủa bằng cách nhỏ từng giọt nước cất
- Dung dịch B: nhỏ 5m l NaOH (40g/100ml) trong 2 0 0 m l etanol 95". Sắc ký được nhúng vào dung dịch A , giữ trong bóng tối 10-15 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau đó cho qua dung dịch B. Sự chuyển dịch các g lu x it được khảo sát bằng cách vết đen bằng cách nhúng các sắc ký vào dung dịch amoniac 2N.
N2: hoá chất oxalat anilin-axit oxalic theo tỉ lệ 2 thể tích dung địch anilin 2m l/100 etanol và 3 thể tích axit oxalic 2,5g/100ml. Sau khi để trong tủ sấy ở nhiệt độ 105"c trong 10-15phút, các aIdohexoza cho màu hơi xanh lá cây. Các xetoza cho màu rất nhạt hoặc không màu. Các oligosaccarit tác dụng chậm do đó phải đun nóng. Quan sát các vết dirới ánh đèn (W OOD)
N ,: hỗn hợp difenilam in anilin-axit octophosphoric (D AP) theo tỉ lệ 5 thể tích dung dịch difenilam in 4% trong etanol 96" + 5 thể tích anilin nguyên chất 3% + 1 thể tích axit ocotophosphoric nguyên chất. Lắc đểu đến mất màu. Sây sắc ký ờ 80-100"C trong 3-5phiít. DAP là chất hiện hình lổng hợp có khả năng tạo màu với cả andoza và hexoza. Các vết của đirờng có liên kết glocozit 1-4 cho màu xanh đến xanh đậm. Nếu không có liên kết thì cho màu xanh nhạt hoặc vàng đậm phụ thuộc vào nồng độ các gluxit.
Thực tế chúng tôi thấy để tách hỗn hợp các g lu x it sử dụng dung môi N|Và hổn hợp hiện hình N , cho kết quả tốt.
Các hoá chất đặc biệt cho các xetoza
- U reclohidric: dung dịch này cho màu xanh da trời hoặc xanh lá cây với các xetoza tự do và các xetoza liên kết. Có thể dùng các axit khác nhưng HCl nhạy hcm cả.
- 96ml etanol 80" và 4m l HCl đậm đặc
- O rcinol: hoà tan 0,5g orcinol và 15g axit tricloroaxetic trong lOOml bão hoà /ỉ-biitanol. Sau k h i phun chất hiện hình, giữ các giấy sắc ký (sắc ký đồ) ở 105"c trong 15-20 phút. Các xetohexoza cho màu vàng; xetopentoza cho màu hơi tím, xetopeptoza cho màu xanh da trời hoặc xanh lá mạ. Còn các axit sialic cho màu nâu vàng.
Tiên hành thí nghiệm
Việc định lượng g lu xit có thể tiến hành ngay sau khi chạy xong dung m ôi bằng phương pháp so màu hoặc tiến hành đo mật độ quang của các vết sau khi đã hiện hình
Xcíc định gliixit trên sắc ký đỗ d ã hiện hình theo hai phương pháp
Phương pháp mật độ quang: độ đậm đặc của các vết được đo bằng quang sắc kế tự ghi. Sau đó sử dụng đường chuẩn hoặc các mẫu đối chứng của các loại g lu xit tinh khiết cho biết nồng độ trước
Phương pháp có tách vết: hoà tan các vết bằng dung m ôi, sau đó xác định khả năng hấp thụ của các dung dịch có màu. Phương pháp này phù hợp với lượng lớn nhất cho m ỗi g lu x it là 50g và sử dụng dung môi chuẩn biết trước lượng g lu xit tương ứng. Sau khi chạy dung m ôi, sấy sắc ký đồ (giấy sắc ký) trong không khí và hiện hình bằng cách nhúng đều trong hoá chất xitrat anilin 1,1M trong cồn tuyệt đối và dung dịch axit c itric IM . Sau đó giữ các sắc ký đồ trong 10-15 phút ở 100-105"c trong tù sấy. Cắt những miếng giấy vuông bao quanh vết, trích li trong 3 giờ bằng dung môi etanol 20% axit H C l 0,5N. xác định khả nãng hấp thụ màu dung dịch ở 400nm.
Xác định gliixit trên sắc ký đồ không liiệii hình
Đánh dấu sự địch chuyển các gluxit trên sắc ký đồ, sau đó tách các đường ra và định lượng chúng bằng phưcmg pháp sắc ký (cho tất cả các vết)
Sau đây xin giới thiệu một thao tác cụ thể tiế ii hành xác định hỗn hợp đường trên sắc ký giấy
Đ ịnh tính
Cắt giấy sắc ký thành từng dải kích thước 17x52cm, đường chấm (A ) cách biên 7cm, gập giấy sắc ký cách biên 2,5cm. Các điểm chấm cách nhau 2,5cm (xem hình 5.4.1)
52 cm
Í ! '5 cm
7 cm
2,5 cm
17 cm
Hình 5.4.1. Giấy sắc ký
Dùng micropipet chấm những chấm dung dịch lên giấy (vừa chấm vừa sấy khô m ới tiếp tục giọt khác). Vết chấm càng nhỏ càng tốt. Trên đường chấm, ký hiệu rõ mẫu chuẩn (gồm các g lu xit tinh khiết) và các mẫu dung dịch thí nghiệm. Chấm xong cho vào máng sắc ký đặt trong hộp sắc ký giấy, m ỗi máng gập 2 lờ hoặc nhiều lờ nếu có thanh đỡ. Rót dung dịch vào m ỗi máng (xem phần dung m ôi). Đậy máng và cho chạy. Theo dõi để đường chạy dung m ôi thảng. K h i dung m ôi đã chạy qua giấy, lấy ra phơi ở nhiệt độ trong phòng thí nghiêm đến khô, cho chạy lần 2 như trên.
Sau khi chạy xong lần 2, sấy khô ở nhiệt độ trong phòng rồi hiện hình bằng hoá chất, hiện hình bằng cách đổ ra khay, tráng giấy sắc ký qua hoặc phun vào giấy sắc ký. Phơi ráo nước rồi cho vào tủ sấy 3-5 phút ở 80-120"C. K h i các vết đã hiện rõ, lấy ra khoanh bút chì vào để đánh dấu. Thường chấm dung dịch chuẩn 2 bên sắc ký đồ để so sánh được chính xác.