1.1. Giới thiệu về carotenoit và β-caroten
1.1.4. Giới thiệu về nấm sợi Blakeslea trispora
1.1.4.1. Giói thiệu chung chung về nấm sợi Blakeslae trispora.
Nấm sợi Blakeslea trispora thuộc Lớp Nấm tiếp hợp, Ngành Nấm tiếp hợp, Bộ Mucorales theo sơ đồ phân loại trình bày ở hình 1.1.2. (Mantzouridou và cs, 2002).
Lớp nấm tiếp hợp Zygomycetes.
Năm 1973 theo hệ thống của Takhtadjan giới nấm mới đ−ợc công nhận (Hesseltine và Ellis).
Ngành nấm tiếp hợp có hai lớp nấm là Zygomycetes và Trichomycetes. Lớp nấm Zygomycetes chỉ chiếm 1% trong giới nấm và sự dụng nguồn cácbon chủ yếu là đ−ờng và tinh bột. Theo từ điển của nấm mốc, Zygomycetes bao gồm 10 bộ, 32 họ, 124 chi, 870 loài (Thaxter 1914). Trong đó 2 bộ Basidiobolales và Mortierellales đã đ−ợc miêu tả bởi Cavalier-Smith, tám bộ còn lại đã đ−ợc thảo luận và minh họa trong các bài báo của Benjamin (1966, 1979), Benny và Donnell (1978). Đặc điểm của lớp nấm này là hữu tính, hệ sợi không có vách ngăn, phổ biến ở bộ Mucorales và Zoopagales, nh−ng hệ sợi có vách ngăn lại phổ biến ở bộ Dimargaritales và Kickxellales (Benny 2001). Sinh sản vô
tính thường ở các loài không chuyển động, bào tử đơn bào trong các nang bào tử là đa hoặc đơn bào.
Họ Choanephoraceae.
Theo Hesseltine và Ellis (1893) họ Choanephoraceac chỉ có một chi là Choanephora.
Sau đó một số tác giả đã tìm ra một vài chi trong các họ sau không có mối liên hệ với nhau Cunninghamella (Cunninghamellaceae), Radiomyces (Radiomycetaceae), Cokeromyces (Thamnidiaceae), Mycotypha (Mycotyphaceae) và Gilbertella (Gilbertellaceae), Rhopalomyces (Helicocephabidaceace), Simoideomyces và Thamnocephalis (Sigmoideomycetaceae) (Kirk 1984, Kirk và cs 2001). Sau một quá trình sắp xếp thì hiện nay họ Choanephoraceac gồm hai chi là Blakeslea và Choanephora.
Giíi : NÊm (fungi)
Ngành: Nấm tiếp hợp (Zygomycota)
Lớp: Nấm tiếp hợp (Zygomycetes)
Bé: Mucorales
Chi: Blakeslea Họ: Choanephoraceae
Loài: trispora
Hình 1.1.2.Sơ đồ phân loại nấm sợi Blakeslea trispora
13 Chi Blakeslea.
Blakeslea có hai loại nang bào tử tách ra từ cuống nang. Nang bào tử lớn chứa từ 1-8 nang bào tử nhỏ hình cầu. Có đ−ờng nối giữa thành tế bào và các bào tử trong các bào tử nhỏ vì vậy các bào tử dễ dàng tách ra khỏi vỏ nang, thậm chí khi chỉ có một bào tử trong
đó. Các bào tử hình ô van dài, có sắc tố, có khía, có râu ở hai đầu bào tử, bào tử sinh ra bằng sinh sản hữu tính hoặc vô tính (Thaxter 1914).
Các loài của Blakeslea bao gồm:
- Blakeslea monospora do Mehrotra và Baijal (1968) phân lập đ−ợc tại ấn Độ và
Đài Loan.
- Blakeslea sinensis do Zheng và Chen (1986) phân lập ở hoa và đất tại Trung Quốc.
- Blakeslea trispora do Thaxter (1914) phân lập đ−ợc đầu tiên từ loài sâu gây bệnh trên cây đậu đũa ở Gainesville, Florida, Mỹ. Sau đó một vài chủng khác cũng đ−ợc phân lập từ đất ở Florida và một vài nơi khác ở vùng Đông Nam nước Mỹ và Châu
á nh− ấn Độ, Trung Quốc (Hsiao và Chang 2003, Ho và Chang 2003)
Nấm sợi là loại tế bào Eukaryote có cấu tạo tương đối phức tạp, có cấu tạo từ các bộ phận chính nh−: vỏ tế bào, nhân, ty lạp thể, nguyên sinh chất và không bào là những thành phần có thể nhìn thấy d−ới kính hiển vi quang học, còn các phần khác nh−: màng nguyên sinh chất, l−ới nội chất…chỉ nhìn thấy đ−ợc d−ới kính hiển vi điện tử. Tế bào của nấm là một tế bào thực sự (eucyte) bao gồm màng tế bào, chất nguyên sinh, tế bào chất, thể hạt nhỏ, ribôxôm, nhân, không bào, các hạt dự trữ.
Nấm mốc sống theo kiểu dị d−ỡng, hấp thụ thức ăn qua vách tế bào của cơ thể nấm.
Màng tế bào của nấm mốc không có lớp xenluloza mà là chất kitin. Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ, các chất dinh d−ỡng đi vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất đi từ tế bào ra môi tr−ờng xung quanh qua những lỗ nhỏ này. Bên ngoài thành tế bào không có lớp nhầy vì thế mà các tế bào không bị dính lại với nhau Thành tế bào Blakeslea trispora có cấu trúc sợi nhỏ từ chitin, chitosan và 1 tổ chức giống gel bao gồm polyglucuronic axít, glucuronomannoproteins và polyphosphate.
L−ợng hydrát cácbon dự trữ trong cơ thể d−ới dạng glycogen. Cơ thể nấm mốc không có cơ quan thần kinh. Nấm mốc phát triển chủ yếu ở phần ngọn của sợi nấm. điều này phụ thuộc vào cấu tạo bên trong của ngọn sợi nấm và thành sợi nấm. Phần ngọn sợi nấm tập trung các hoạt động liên quan tới quá trình tổng hợp prôtít. Đây là yếu tố điều khiển, xử lý các dây chuyền tổng hợp: nhân tế bào, hệ thống các axit nucleic, hệ thống enzim cần thiết. Prôtít ngoài việc duy trì hoạt động sống của cơ thể nấm mốc còn dùng để xây dựng phần nấm sợi mới. Thành của sợi nấm ở phần đỉnh mỏng hơn các phần khác. Nh−ng phần đỉnh vẫn đ−ợc coi là phần bảo vệ, nó phải tiếp xúc với vật cản đầu tiên, khi cần là mũi nhọn luồn lách vật cản. Một bào tử nấm mốc có ít nhất 2-3 sợi nấm non (cũng có thể
coi đây là ống nảy sợi), từ một sợi nấm non sẽ hình thành hàng trăm sợi nấm khác, đây là hiện t−ợng mọc nhánh của sợi nấm.
Nguyên sinh chất của tế bào bao gồm màng nguyên sinh chất, tế bào chất và nhân:
+ Màng nguyên sinh chất nằm sát bên trong thành tế bào và làm nhiệm vụ hấp thụ các chÊt dinh d−ìng.
+ Tế bào chất là hệ thống keo phức tạp đ−ợc tạo thành từ protein, gluxit, lipit, các chất khoáng phân tán trong môi tr−ờng n−ớc. Trong tế bào chất có các ty thể, riboxom, thể golgi, mạng l−ới nội chất, thể màng biên (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999).
Trong sợi nấm dòng nguyên sinh chất chuyển động theo hướng từ phần sợi nấm đã
trưởng thành tới ngọn sợi nấm. Phần ngọn sợi nấm các thành phần cấu tạo liên quan đến quá trình tạo chất tế bào và các nguyên liệu cần thiết cho quá trình này cũng nhiều hơn các thành phần khác của sợi nấm. Nhân tế bào có vai trò quan trọng đối với nhiều hoạt
động của sợi nấm, thành phần cơ bản của nhân tế bào gọi là prôtít nhân (hay nucleprotein). Nhân của tế bào là hình cầu có màng bao bọc, trong nhân có nhân con (nucleolus) bao gồm có protein, ADN, ARN và enzim. Chức năng của nhân là quyết định tính di truyền và tham gia điều kiện hoạt động sống. Các enzim không những tham gia có tính chất quyết định vào các hoạt động sinh lý cơ bản bên trong sợi nấm mà còn đóng góp quyết định vào quá trình hấp thụ thức ăn bên ngoài. Enzim đóng vai trò cắt các phân tử tinh bột thành các phân tử đường, các phân tử chất xơ thành đường, phân tử prôtít động thực vật thành các axit amin. Trong các sợi nấm có chất dự trữ là gluxít, một số loài dự trữ
ở dạng lipit. Lipit có trong thành phần của vách sợi nấm (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999).
Nấm mốc hấp thụ các axit amin tạo nên các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào d−ới dạng các thành phần (các bazơ nitơ) của axit nhân (axit nucleic). Thứ tự bazơ nitơ trong phân tử mốc đối với mỗi loại mốc là khác nhau. Các thể riboxom nằm rải rác trong chất nguyên sinh, đây là nơi sản xuất ra protein. Ty thể của tế bào nấm nhiều và đa dạng.
Không bào chứa dịch tế bào (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999).
Thức ăn không chỉ cung cấp các nguyên liệu để cơ thể nấm mốc sản xuất thường xuyên chất nguyên sinh, sợi nấm, chất dự trữ mà còn cung cấp năng l−ợng cho các hoạt
động của cơ thể sống, trong đó có các hoạt động "sản xuất" các thành phần cấu tạo nên cơ
thể. Thức ăn và các thành phần cấu tạo nên cơ thể gồm một hoặc một số các hợp chất hoá
học nh−: gluxít, prôtít, lipid, axit nhân, vitamin, muối phốtphát, nitrát. Mỗi hợp chất hoá
học đều do nhiều thành phần liên kết với nhau. Các hợp chất đơn giản như nước, muối vô
cơ các phần này chỉ là các nguyên tố: H2, O2, P, S...Năng l−ợng tạo ra các liên kết đó là hoá năng. Mỗi dạng liên kết tương đương với một số năng lượng nhất định. Một số mối liên kết của các hợp chất trong cơ thể sống giữ một l−ợng năng l−ợng đặc biệt lớn, đó là những liên kết cao năng. Sự phát triển của nấm mốc còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường: nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy...(Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999).
15 1.1.4.2. Đặc điểm hình thái và sinh sản loài Blakeslea trispora.
Blakeslea trispora là nấm sợi, giữa hệ sợi không có vách ngăn, sinh sản vô tính hoặc h÷u tÝnh (H×nh 1.1.3.).
* Sinh sản hữu tính.
Trong tất cả các thí nghiệm đã thực hiện, sự sinh sản hữu tính sảy ra khi khuẩn lạc của 2 chủng có giới tính đối lập phát triển tạo sợi nấm. Hai sợi nấm song song vói nhau mang giới tính đối lập (-) và (+) hay còn gọi là giao tử đực và giao tử cái, sợi nấm phát triển dài ra theo h−ớng phía tr−ớc và hình thành túi giao tử non ở đầu các sợi nấm. Vách ngăn trong túi giao tử non phát triển vào tạo tạo nang giao tử, các nang giao tử này sẽ dung hợp giới tính với nhau tạo thành trứng, đầu mỗi nhánh phình to ra, chỗ tiếp xúc của hai đầu nhánh xuất hiện một khối cầu mầu đen xù xì. Khi nhánh của mỗi sợi nấm chạm
đầu vào nhau có nghĩa là giao tử đực và giao tử cái tiếp xúc với nhau (Lampila và cs 1985).
Khi đó vách tế bào ở chỗ tiếp xúc bị tiêu huỷ để hai giao tử thông với nhau. Chất tế bào và nhân tế bào ở giao tử đực bị hút sang giao tử cái sau đó cả chất tế bào và nhân tế bào của 2 giao tử hoà trộn với nhau để thành 1 tế bào trong cái vỏ của giao tử cái. Tế bào mới này chính là trứng đã đ−ợc thụ tinh, trứng này phòng to, lớn lên, vỏ cũng dầy lên và càng ngày càng đen, càng sù sì, khối sù xì này là bào tử tiếp hợp, bào tử này không nảy mầm ngay thành cơ thể mới mà phát triển thành nhánh thẳng đứng, sau đó tiếp tục phát triển thành nang bào tử kín. Nang bào tử kín vỡ ra tung bào tử kín ra bên ngoài. Rất khó phân biệt đ−ợc bào tử kín có giới tính đối lập (+) và (-) vì không có đặc điểm khác biệt.
Các bào tử tiếp tục nẩy mầm và có thể phối hợp hữu tính tiếp tục hoặc phát triển riêng biệt theo ph−ơng pháp vô tính. Bào tử tiếp hợp có chức năng tổng hợp các sản phẩm sinh học trong khi sợi nấm (hyphae) không có vai trò gì trong việc sản xuất β-caroten. Nh− vậy có sự t−ơng ứng tuyến tính giữa vùng không gian của bào tử tiếp hợp và hàm l−ợng β- caroten. Blakeslea trispora là loại vi nấm đa hình (polymorphíc) tổng hợp β-caroten với chu trình vòng đời bao gồm sợi nấm (hyphae), sợi nấm tiếp hợp (zygophores) và bào tử tiếp hợp (zygospo res)(Lampila và cs 1985).
Hình 1.1.3. Chu trình sinh sản vô tính và hữu tính
của Blakeslea trispora. Trứng hình thành trong chu trình sinh sản hữu tính của Blakeslea trispora trên môi tr−ờng PDA
17 * Sinh sản vô tính:
Trong sinh sản vô tính, bào tử đ−ợc hình thành ở phía trong do có cấu tạo túi bào tử.
Túi bào tử có cấu trúc điển hình hơn cả chúng có dạng hình cầu nhỏ đ−ờng kính khoảng 80-120 àm chứa từ một đến hàng nghìn bào tử. Những bào tử chứa đầy ở bên trong khoang của túi (Ho và Chang 2003).
* Các giai đoạn hình thành và phát triển của Blakeslea trispora.
Khuẩn lạc Blakeslea trispora phát triển trên môi trường thạch đĩa, giai đoạn đầu hệ sợi có màu trắng, phát triển dầy đặc dần, hệ sợi cong có nhánh phủ kín bề mặt đĩa. Các giai đoạn phát triển thể hiện nh− sau (hình 1.1.4.) (Ho và Chang 2003):
1. Cuống nang hình cong trong giai đoạn nang bào tử kín đang phát triển (S).
2. Nang bào tử kín phát triển đến giai đoạn chín, bên trong có nhiều bào tử (S).
3. Trụ nang C và cổ trụ nang Co.
4. Thành các nang bào tử kín tách ra (SW) giải phóng các bào tử kín.
5. Các nang bào tử kín giải phóng khỏi nang bảo tử lớn, dọc theo chiều dài của nang bào tử kín có phần râu mọc ở 2 đầu (A).
6. Đỉnh của các bào tử kín thắt lại với nhau, gắn lên trên bề mắt hình cầu (V).
Các cuống nang sinh ra các nang bào tử kín mọc ra từ hệ sợi, cuống nang mọc thẳng, không phân nhánh, cuống nang cao 1- 4mm, rộng 13-20 àm, nang bào tử kín khi còn nhỏ hình cầu có đường kính (30-) 60-90 (-210) àm. Giai đoạn đầu màu trắng sau đó có màu n©u ®en.
Khi tr−ởng thành nang bào tử lớn có màng bên ngoài bao bọc, mầu nâu, lớp vỏ ngoài chắc, sau đó nứt ra làm hai nửa, cuống nang biến mất khỏi các nang bào tử nhỏ, tại thời
điểm đó các nang bào tử nhỏ có hình quả lê, trong suốt dài (40-) 55- 90 (-100) àm, rộng 30-40 àm, th−ờng có núm..
7. Giai đoạn phát triển nang bào tử hình cầu (V), sau đó tách thành các nang hình cầu nhỏ bám trên bề mặt hình cầu lớn.
8. Ba bào tử đ−ợc tách ra.
9. Phá vỡ thành tế bào để các bào tử tách ra.
10. Các bào tử tách ra có cuống noãn.
11. Bào tử tiếp hợp cùng với cuống noãn
Bào tử từ nang bào nhỏ hình ellíp, phần rộng của ellíp khoảng (5-) 6-8 àm màu nâu đỏ, chiều dài (10-) 12-18 àm. Hai đầu bào tử có râu, râu dài gấp 2 lần chiều dài bào tử. Cuống nang sinh ra nang bào tử từ hệ sợi cao 1-5 mm, rộng 13-20 àm, ở phía đầu không phân nhánh, thành hệ sợi trơn nhẵn, trong suốt không có vách ngăn, các nhánh bắt
đầ thắt lại và giai đoạn cuối tạo ra một hình cầu lớn có đ−ờng kính 22-35 àm, các nang bào tử sinh ra trên bề mặt của đoạn phình hình cầu lớn, mỗi cuống nang sinh ra (1-) 8- 16 (-32) hình cầu nhỏ. Nang bào tử nhỏ hình ellip, gắn vào hình cầu lớn là các cuống của
hình cầu nhỏ dài 3-5àm, rộng 2,5 àm, mỗi hình cầu nhỏ chứa 3 bào tử (thậm chí còn có thể lên tới 4 bào tử) chúng rất mảnh nh−ng chắc, trong suốt, khi tr−ởng thành phá vỡ
đ−ờng nối thành hai đoạn.
Các bào tử từ nang bào tử hình ellip, chiều rộng của ellip có màu nâu đỏ, dài 12.5- 15(-18) àm, rộng 6-7.5(-8) àm, phần râu có chiều dài bằng chiều dài của bào tử. Bào tử tiếp hợp đ−ợc tạo thành ở d−ới bề mặt của môi tr−ờng, có đ−ờng kính 40-80 àm, hình cầu, mảnh, phẳng, ở tâm hình cầu có giọt dầu nhỏ ở giai đoạn tr−ởng thành, lớp thành phía ngoài mỏng hơn, có đ−ờng kẻ sọc. Thành bên trong dầy, nhẵn, cuống noãn kẹp ép vào, không có phần phụ, sinh ra từ vòng xoắn của sợi nấm, đ−ờng kính khoảng 10-80 àm mảnh.
19
1 2
3 4
5 6
Hình 1.1.4.Các giai đoạn phát triển của bào tử Blakeslea trispora 1. Cuống nang hình cong trong giai đoạn nang bào tử kín đang phát triển (S).
2. Nang bào tử kín phát triển đến giai đoạn chín, bên trong có nhiều bào tử (S).
3. Trụ nang C và cổ trụ nang Co.
4. Thành các nang bào tử kín tách ra (SW) giải phóng các bào tử kín.
5. Các nang bào tử kín giải phóng khỏi nang bảo tử lớn, dọc theo chiều dài của nang bào tử kín có phần râu mọc ở 2 đầu (A).
6. Đỉnh của các bào tử kín thắt lại với nhau, gắn lên trên bề mắt hình cầu (V).
7
8
9 10 11
Hình 1.1.4. Giai đoạn phát triển của bào tử
7. Giai đoạn phát triển nang bào tử hình cầu(V), sau đó tách thành các nang hình cầu nhỏ bám trên bề mặt hình cầu lớn
8. Ba bào tử đ−ợc tách ra
9. Phá vỡ thành tế bào để các bào tử tách ra 10. Các bào tử tách ra có cuống noãn
11. Bào tử tiếp hợp cùng với cuống noãn
21 1.1.4.3. Quá trình tổng hợp β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora.
Các terpenoit đều bắt nguồn từ tiền chất chung là isopentenyl pyrophosphate. Chất này đ−ợc tổng hợp theo chu trình Mevalonate (Hình 1.1.5.). 3-Hydroxymethylglutaryl coenzim A (HMG-CoA) và mevalonate là các chất trung gian của chu trình mevalonate.
Gene mã hoá cho hai enzim đầu tiên của chu trình mevalonate là HMG-CoA synthase và HMG-CoA reductase đã đ−ợc tách dòng ở Phycomycetes và nó đã đ−ợc giải trình tự từ bốn chủng thuộc bộ Mucorales. Sinh tổng hợp terpenoid đ−ợc hình thành thông qua quá
trình trùng ng−ng mạch 5 cacbon tạo thành các phân tử lớn hơn nh− geranyl pyrophosphate, farnesyl pyrophosphate, geranylgeranyl pyrophosphate. Qúa trình tổng hợp carotenoid cần 2 phân tử geranylgeranyl-PP sau đó enzim dehydrogenase xúc tác phản ứng dehydro liên tiếp 4 lần trên phytoen. Khi giải phóng nhóm pyrophosphate đầu tiên sẽ tạo ra tiền phytoene pyrophosphate và giải phóng nhóm pyropohossphate thứ hai tạo nên phytoene. Theo các tài liệu nghiên cứu công bố gần đây, quá trình bão hoà đ−ợc tạo nên thông qua các phản ứng dehydrogen trong đó hydrogen chuyển đến phân tử NADP hoặc FAD. Một enzim khác là cyclase vòng hoá lycopen hình thành α-caroten, tiếp tục vòng hoá α-caroten tạo β-caroten (Goodwin, 1980).