3.1.1.1.Khảo sát khả năng phát triển và sinh tổng hợp β-caroten từ các chủng nấm sợi B. trispora trên môi tr−ờng nhân giống và lên men cơ bản.
Nuôi cấy riêng rẽ các chủng giống B. trispora WH1(+), WH2(-) trên môi tr−ờng thạch PDA, chủng NBRC 5989 (+) trên môi tr−ờng PSA ở 280C, trong 5 ngày. Trên môi tr−ờng lỏng (môi tr−ờng lên men cơ bản: glucoza, muối khoáng, L-asparagine và vitamin B1, dầu đậu t−ơng, BHT (chất chống oxy hoá) lên men trên bình tam giác 500ml chứa 50ml dịch, l−ợng giống tiếp vào đạt mật độ 105TB/ml, chế độ lắc 250v/phút, thời gian lên men 5 ngày, ở 280C, pHlên men=6). Kết quả quan sát bằng kính hiển vi đ−ợc thể hiện trong hình 3.1.1.; 3.1.2; bảng 3.1.1; 3.1.2 cho thấy:
* Trên môi tr−ờng thạch PDA, PSA:
- Hệ sợi mầu trắng xuất hiện sau 48 giờ nuôi cấy.
- Túi bào tử, bào tử tự do có khía và râu ở hai đầu có mầu đen đối với hai chủng WH1(+), WH2(-), mầu nâu đen đối với chủng NBRC 5989 (+) tại thời điểm 72 giê .
* Trên môi tr−ờng lên men:
- Sau 48 giờ hệ sợi phát triển có mầu trắng, không có vách ngăn, xuất hiện nhiều không bào.
- Đầu các sợi nấm phình to, trong hệ sợi xuất hiện các bọng mầu vàng chứa β- caroten sau 72 giờ nuôi cấy, tăng dần và đạt cao nhất sau 120 giờ nuôi cấy. Kéo dài thời gian nuôi cấy có hiện t−ợng thiếu dinh d−ỡng và trên thành bình lên men có tạo bào tử đen, sinh khối nấm men không tăng, hàm l−ợng β-caroten bắt
đầu giảm dần.
Bảng 3.1.1. Hình thái bào tử, sợi nấm B. trispora trên các môi tr−ờng nuôi cấy.
Thêi gian (giê)
Môi tr−ờng PDA B. trispora WH1 (+), WH2 (-)
Môi tr−ờng PSA B. trispora NBRC 5989(+)
Môi tr−ờng lên men
48
Sợi nấm bắt đầu phát triển, dạng tơ ngắn có màu trắng ngà, bông.
Sợi nấm bắt đầu phát triển, dạng tơ ngắn có màu trắng ngà, bông.
Sợi nấm phát triển chậm, mầu trắng ngà, không có vách ngăn, không bào nhiều và rõ.
72
Sợi nấm phủ đầy mặt thạch. Xuất hiện túi bào tử chứa nhiều bào tử nhỏ bên trong và bào tử tự do hình bầu dục, có các búi râu mảnh ở hai đầu, mầu
®en.
Sợi nấm phủ đầy mặt thạch. Xuất hiện túi bào tử chứa nhiều bào tử nhỏ bên trong và bào tử tự do hình bầu dục, có các búi râu mảnh ở hai đầu, mÇu n©u ®en.
Sợi nấm phát triển dài, to hơn, tạo thành búi, đầu các sợi nấm xuất hiện các bọng nhỏ.
96 -120
Mật độ bào tử cao với B. trispora WH1 và thấp hơn với WH2. Chủ yếu là bào tử tự do, nhìn rõ các búi râu mảnh hai đầu và các khía dọc trên bề mặt bào tử.
Mật độ bào tử thấp hơn B. trispora WH1 WH2. Chủ yếu là bào tử tự do, nhìn rõ các búi râu mảnh hai đầu và các khía dọc trên bề mặt bào tử.
Sợi nấm và các bọng đầu sợi nấm phát triển, phình to, nhìn rõ màu vàng càng rõ và đậm dần trong các không bào của sợi nấm và các bọng đầu sợi nấm.
Bảng 3.1.2. Khả năng tạo β-caroten trên môi tr−ờng cơ bản của các chủng B.trispora Tên chủng giống Hàm l−ợng sinh khối (g/L) Hàm l−ợng β-caroten (mg/L)
B. trispora WH1(+) 25,8 98,6
B. trispora WH2(-) 27,4 103,3
B. trispora NBRC 5989(+) 22,6 78,2
Khả năng phát triển và sinh tổng hợp β-caroten của 3 chủng B.trispora WH1(+), WH2(-), NBRC 5989(+) không chênh lệch nhiều do vậy chọn cả ba chủng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Trên cơ sở đó có số liệu cơ bản về ba giống để lên men lớn và thực hiện phối giống, đột biến giống nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten.
Hình 3.1.1. Nuôi cấy các chủng B. trispora trên bình tam giác và ống nghiệm sử dụng môi tr−ờng PDA, PSA
Hình 3.1.2. Quá trình hình thành bào tử B.trispora trên máy hiển vi điện tử có độ phóng đại 750 lần
Bào tử túi (A) và bào tử tự do (B) của B. trispora khi nuôi cấy trên môi tr−ờng PDA, PSA (ảnh chụp trên kính hiển vi quang học x 1000)
E D C
Hình 3.1.3. Hệ sợi (C) và các bọng (D) hình thành ở các đầu sợi nấm, màu vàng (E) càng rõ và đậm dần trong các không bào của sợi nấm B. trispora khi nuôi cấy trong môi tr−ờng lên men dịch thể trên máy lắc(ảnh chụp d−ới kính hiển vi quang học, x 400 (C) và x 1000 (D,E))
A B
Nghiên cứu động học quá trình nuôI cấy B. trispora tổng hợp β-caroten:
Trước tiên chúng tôi khảo sát động học quá trình nuôi cấy chủng nấm sợi B.
trispora 5989. Kết quả thu đ−ợc trình bày ở bảng 3.1.3 và hình cho thấy:
Bảng 3.1.3. Động học quá trình lên men chủng B.trispora5989 trên máy lắc
STT Thời gian lên men(ngày)
Giá trị pH (± 0,01)
Hàm l−ợng sinh khối khô(g/l)
(± 0,1)
Hàm l−ợng beta- carotene (mg/l)
(± 1,0)
1 2 6,6 18,42 21,09
2 3 7,0 20,55 29,85
3 4 7,3 21.93 64,68
4 5 7,5 21,30 48,09
5 6 6,2 20,92 51,57
6 7 6,2 19,80 52,62
7 8 6,0 19,17 45,34
8 9 7,5 18,17 45,60
9 10 7,8 17,29 40,88
0 10 20 30 40 50 60 70
2 3 4 5 6 7 8 9 10
thời gian lên men (ngày)
hàm lượng beta-carotene (mg/l)
15 16 17 18 19 20 21 22 23
hàm lượng sinh khối (g/l)
hàm lượng beta- carotene (mg/l) hàm lượng sinh khối khô (g/l)
Hình 3.1.2. Động học quá trình lên men sinh tổng hợp β-caroten của chủng B.
trispora 5989
- Hàm l−ợng β-caroten đạt giá trị cao nhất tại ngày thứ 4.
- Sau 4 ngày lên men hàm l−ợng β-caroten tăng gấp 3 lần so với ngày đầu; hàm l−ợng sinh khối tăng 1,2 lần.
- Khả năng sinh beta-caroten không thay đổi nhiều trong khoảng thời gian từ 4
đến 7 ngày.
- pH trong 5 ngày đầu tăng dần, sau đó giảm nhẹ và lại tăng dần bắt đầu từ ngày thứ 9.
Dựa vào biểu đồ ta thấy hàm l−ợng β-caroten tăng dần trong 3 ngày đầu và giảm dần ở những ngày tiếp theo nh−ng không đáng kể cho đến ngày thứ 7. Hàm l−ợng β- caroten giảm dần bắt đầu từ ngày thứ 7. Hàm l−ợng β-caroten giảm có thể là do sự oxy hoá chất màu trong quá trình đồng phân hoá và tổng hợp do enzim oxidaza có trong nấm mốc gây ra. Chúng tôi cũng thấy là không có mối quan hệ tuyến tính nào giữa hàm l−ợng chất màu tạo thành với hàm l−ợng sinh khối. Khi hàm l−ợng β-caroten đạt giá trị lớn nhất thì hàm l−ợng sinh khối bắt đầu hơi giảm có lẽ là do có hiện t−ợng tự phân tế bào.
pH trong 5 ngày đầu tăng dần, sau đó giảm nhẹ và lại tăng dần ở ngày thứ 9. Tại giá trị pH trung tính hàm l−ợng β-caroten đạt cao nhất. Sau đó pH hơi giảm và lại tăng có lẽ là do quá trình nấm đề amin hoá các axít amin của dịch chiết ngô và tạo thành amoniac làm tăng pH của môi tr−ờng.
Nghiên cứu ảnh h−ởng của điều kiện chiếu sáng:
Blakeslea trispora có khả năng sinh tổng hợp β-caroten trong điều kiện không có
ánh sáng. Tuy nhiên một số nghiên cứu khác trên thế giới đã chứng tỏ là ánh sáng xanh (blue) có khả năng kích thích sự tạo thành các sắc tố đỏ trong đó có β-caroten.
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến khả năng sinh tổng hợp β-caroten của chủng 5989. Thí nghiệm đã đ−ợc tiến hành ở 3 chế độ:
Chiếu sáng hoàn toàn; chiếu sáng trong 2 ngày đầu lên men sau đó đem lên men ở chế
độ tối trong 2 ngày cuối; chế độ tối hoàn toàn. Kết quả đ−ợc thể hiện trong bảng 3.1.4.
và hình 3.1.3.
Bảng 3.1.4. Nghiên cứu điều kiện chiếu sáng đến sinh trưởng phát triển và tổng hợp β-caroten của B. trispora 5989
Chế độ chiếu sáng
Hàm l−ợng sinh khèi
(g/l)
Hàm l−ợng β-caroten
(mg/l)
Hàm l−ợng β-caroten (mg/gsk khô)
Sáng 20,87 52,10 2,45
Sáng + Tối 21,79 82,58 3,77
Tèi 21,05 58,16 2,76
Với chế độ phối hợp sáng và tối thì hàm l−ợng β-caroten sinh tổng hợp đ−ợc đạt giá trị cao nhất. Trong điều kiện chiếu sáng phối hợp, khả năng sinh tổng hợp β- caroten cao hơn 1,29 lần so với khi lên men có chiếu sáng và cao hơn 1,37 lần so với khi lên men trong bóng tối.
0 20 40 60 80 100
Sáng Sáng+Tối Tối
Chế độ
Hàm l−ợng sinh khối(g/l)
Hàm l−ợng sinh khèi(g/l)
Hàm l−ợng beta- carotene(mg/l)
Hình 3.1.3. ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến sự phát triển và tổng hợp β- caroten của B. trispora 5989
Dựa vào hình 3.1.3. ta có thể thấy ở chế độ chiếu sáng phối hợp hàm l−ợng β- caroten đạt cao nhất, cao hơn 1,58 lần so với chế độ lên men chiếu sáng hoàn toàn
đồng thời cao hơn chế độ lên men trong bóng tối 1,4 lần.
L−ợng sinh khối thu đ−ợc ở cả 3 chế độ chiếu sáng không khác biệt nhau lớn. Điều này chứng tỏ chế độ chiếu sáng không ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của loài nấm sợi này.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm lắc và lên men có thể tuân thủ theo chế độ cả tối và sang xen kẽ. Nh−ng khi sản xuất thực nghiệm, chúng ta không có các thiết bị lên men lớn có thể sử dụng ánh sáng. Vì vậy, chúng tôi thực hiện các nghiên cứu tiếp sau trong các điều kiện hiện có tại các cơ quan nghiên cứu và sản xuất thực nghiệm các chÕ phÈm vi sinh vËt.
3.1.1.2. Nghiên cứu ảnh h−ởng của thành phần môi tr−ờng và điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp β-caroten của các chủng B.trispora.
3.1.2.1.1. ảnh h−ởng của thành phần môi tr−ờng đến sự tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora.
ảnh h−ởng của nguồn cacbon:
Tiến hành nghiên cứu ảnh h−ởng của nguồn cácbon tới quá trình sinh tổng hợp β- caroten của 3 chủng. Trên môi trường cơ bản làm đối chứng, chỉ thay thế glucoza bằng glucoza, sacaroza, lactoza, galactoza, glycerol, tinh bột ngô, bột ngô có nồng độ 50g/L
và dịch đường hoá bột ngô, các điều kiện lên men như đã trình bầy ở mục3.1. Kết quả
đ−ợc trình bầy ở bảng 3.1.5. cho thấy:
Bảng 3.1.5. ảnh h−ởng của nguồn cacbon tới khả năng tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora
Hàm l−ợng sinh khối khô (g/L) Hàm l−ợng β-caroten (mg/L ) Nguồn cácbon
WH1 5989 WH2 WH1 5989 WH2
Glucoza (MT cơ bản)
25,8 22,6 27,4 98,6 78,2 103,3
Sacaroza KPT 7,2 KPT - 26,0 -
Lactoza 29,4 22,5 28,5 78,5 60,7 72,2
Galactoza 28,5 20,1 29,4 50,7 39,0 42,6
Glycerol KPT KPT KPT - - -
Bột ngô 26,6 23,6 28,9 113,8 99,7 133,9
Tinh bột ngô 25,1 22,0 26,5 97,2 71,5 83,9
Dịch đ−ờng hoá
bột ngô
21,0 20,0 20,1 32,4 53,0 38,68
Ghi chú: KPT: không phát triển; (-): không xác định
- Trên môi tr−ờng với nguồn cácbon là glycerol và sacaroza hai chủng WH1, WH2 đều không không phát triển.
- Chủng 5989 phát triển trên môi tr−ờng sacaroza nh−ng hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten thấp, không phát triển trên môi tr−ờng glycerol.
- Nguồn cácbon là bột ngô, tinh bột ngô cho hiệu suất tổng hợp β-caroten cao hơn lactoza, galactoza. Đặc biệt là bột ngô cho hiệu suất sinh tổng hợp β- caroten cao nhất, vì vậy chọn bột ngô là nguồn cácbon thích hợp cho môi tr−ờng lên men của 3 chủng.
ảnh h−ởng của nguồn nitơ:
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đối các chủng B.trispora, thay L-asparagin bằng NH4NO3, NaNO3, cao nấm men, pepton, urê, cao ngô với nồng độ 10g/L, sử dụng môi trường có nguồn cácbon thích hợp làm đối chứng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1.6 cho thÊy:
- L-asparagine cho hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten cao nhất đối với cả 3 chủng B. trispora. Cao ngô cho hiệu suất tạo β-caroten cao (105 mg/L và 125,9mg/L)
đối với 2 chủng WH1,WH2,chủng NBRC 5989 nguồn pepton cho hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten cao (95 mg/L).
- Cả ba chủng B. trispora nghiên cứu hầu nh− không phát triển trên môi tr−ờng (NH4)2SO4, urê, còn trên môi tr−ờng NH4NO3, NaNO3 chúng phát triển rất kÐm.
Bảng 3.1.6. ảnh h−ởng của các nguồn nitơ tới quá trình sinh tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora
Hàm l−ợng sinh khối (g/L) Hàm l−ợng β-caroten (mg/L ) Môi tr−ờng
WH1 5989 WH2 WH1 5989 WH2
Đối chứng 26,6 23,6 28,9 113,8 99,7 133,9
NH4NO3 1,7 3,4 1,8 12,5 3,5 19,5
NaNO3 2,0 6,6 2,1 42,3 6,4 56,8
Urê KPT KPT KPT - - -
(NH4)2SO4 KPT KPT KPT - - -
Cao ngô 25,2 15,0 27,7 105,0 65,1 125,9
Cao nÊm men 23,8 27,5 20,2 85,7 93,0 62,0
Pepton 20,0 22,0 17,4 64,8 95,0 55,0
Casein thuû ph©n 20,6 11,5 23,1 72,0 10,5 64,4
Bét nÊm men 19,2 15,0 20,2 77,5 29,0 97,4
Ghi chú: KPT: không phát triển; (-): không xác định.
Nghiên cứu ảnh h−ởng của nồng độ cao ngô, pepton tới hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora.
Để tăng hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten ở cả 3 chủng WH1,WH2, NBRC 5989, chúng tôi đã tiến hành kết hợp bổ sung hỗn hợp cao ngô, pepton phù hợp cho mỗi chủng.
Lên men các chủng WH1, WH2 trên các môi tr−ờng có nguồn cácbon thích hợp (MTC) bổ sung thêm cao ngô với nồng độ nh− sau:
- MT1= MTC + 30g/L cao ngô, MT2=MTC + 40g/L cao ngô.
- MT3= MTC + 50g/L cao ngô, MT4= MTC + 60g/L cao ngô.
- MT5= MTC +70g/L cao ngô.
Kết quả thu đ−ợc ở bảng 3.1.7 và 3.1.8 cho thấy:
- Hàm l−ợng β-caroten tăng, khi tăng nồng độ cao ngô từ 30-50g/l hàm l−ợng β- caroten tăng từ 350,5mg/l dến 784 mg/l đối với chủng WH1, tăng từ 410,2 mg/L
đến 875,5mg/L đối với chủng WH2.
- Tiếp tục tăng nồng độ cao ngô thì hàm l−ợng β-caroten tăng không đáng kể mặc dù l−ợng sinh khối vẫn tăng. Chọn MT3 có nồng độ cao ngô là 50g/L là thích hợp nhất đối với với WH1, và WH2.
Với chủng 5989, lên men trên môi tr−ờng có nguồn cácbon chọn lọc (MTC) có bổ sung thêm pepton nh− sau:
MT1 = MTC + 2,5g/L pepton; MT2 = MTC + 5g/L pepton.
MT3 = MTC+ 7,5g/L pepton; MT4 = MTC+ 10g/L pepton.
Bảng 3.1.7. Nồng độ cao ngô thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp β-caroten của 2 chủng B. trispora WH1,WH2
Hàm l−ợng sinh khối khô (g/L) Hàm l−ợng β-caroten (mg/L ) Môi tr−ờng
WH1 WH2 WH1 WH2
Đối chứng 26,7 29,0 113,7 140,0
MT1 31,4 34,5 350,5 410,2
MT2 32,2 35,5 456,3 586,0
MT3 34,5 36,6 784,0 875,5
MT4 34,8 36,8 784,7 876,0
MT5 35,0 40,0 785,0 876,2
Bảng 3.1.8. Lựa chọn nồng độ pepton thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp β-caroten của chủng B. trispora NBRC 5989
Môi tr−ờng Hàm l−ợng sinh khối khô (g/L) Hàm l−ợng β-caroten (mg/L )
Đối chứng 23,6 99,8
MT1 31,5 405,2
MT2 33,0 760,5
MT3 33,5 761,1
MT4 34,0 762,1
- Hàm l−ợng β-caroten tăng dần khi tăng nồng độ pepton tăng từ 2,5 - 5 g/l.
- Tiếp tục tăng pepton lên nồng độ 7,5g/L, 10g/L hàm l−ợng β-caroten và sinh khối tăng không đáng kể. Chọn MT2 có nồng độ 5g/L pepton là thích hợp nhất cho chủng B.trispora 5989.
Nghiên cứu ảnh h−ởng của chất hoạt động bề mặt:
Chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng lớn tới 3 chủng WH1,WH2, NBRC 5989. Lên men bổ sung chất hoạt động bề mặt Span 20 (nồng độ 2,5; 5; 7,5g/L), Tween 80 (với nồng độ 0,5; 1; 1,5 g/L) vào môi trường chọn lọc với nguồn nitơ, cácbon (MTCL),
đồng thời bổ sung kết hợp cả 3 loại trên với thành phần nh− sau:
MT1= MTCL +Tween 80 (0,5g/L) + Span 20 (2,5g/L) MT2= MTCL +Tween 80 (1g/L) + Span 20 (5g/L) MT3= MTCL +Tween 80 (1,5g/L) + Span 20 (7,5g/L)
Kết quả thể hiện ở bảng 3.1.9 cho thấy
Bảng 3.1.9. Lựa chọn chất hoạt động bề mặt thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp β- caroten của các chủng B. trispora
Hàm l−ợng sinh khối khô (g/L) Hàm l−ợngβ-caroten (mg/L) Chất hoạt
động bề mặt
Nồng độ
(g/L) WH1 5989 WH2 WH1 5989 WH2
2,5 34,8 33,2 36,6 810,0 792,0 895,2
5,0 35,0 33,6 37,9 950,8 811,0 950,0
Span 20
7,5 35,1 33,8 36,6 790,2 765,4 889,0
0,5 34,7 33,1 36,7 820,0 780,2 900,0
1,0 35,2 33,2 36,8 985,7 814,0 960,5
Tween 80
1,5 35,3 33,4 37,0 789,6 767,0 897,0
Đối chứng 34,5 33,0 36,5 784,0 760,2 875,1
MT1 36,2 33,0 37,4 1105,2 820,9 1250,2
MT2 37,5 34,1 38,0 1456,0 950,0 1560,0
MT3 33,2 30,0 34,5 750,4 750,0 870,6
- Hàm l−ợng β-caroten tăng dần theo việc tăng nồng độ Span 20 (từ 2,5-5g/L) và Tween 80 (tõ 0,5-1g/L).
- Tăng hàm l−ợng Span 20 tới 7,5g/L và Tween 80 tới 1,5 g/L sẽ ức chế quá trình hình thành β-caroten.
- Bổ sung kết hợp cả Tween 80 và Span 20 hàm l−ợng β-caroten tăng lên đáng kể với chủng WH1 có thể đạt tới 1456 g/L, WH2 là 1560 g/L, 5989 là 950 g/L.
- Chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng lớn nhất tới 2 chủng WH1 và WH2 nhiều hơn là đối với chủng 5989.
- Các chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng không lớn tới hàm lượng sinh khối tạo thành nh−ng lại ảnh h−ởng rất lớn tới quá trình tạo β-caroten của cả ba chủng
điều này có thể giải thích các chất hoạt động bề mặt có khả năng tăng diện tích không bào, thúc đẩy quá trình hình thành β-caroten.
- Khi sử dụng Span 20 và Tween 80 chúng tôi nhận thấy sợi nấm có độ dài ngắn hơn, giúp tránh đ−ợc sự xoắn kết của hệ sợi và giúp cho hệ sợi phân tán tốt, nhờ đó các tế bào nấm có thể trao đổi chất tốt với môi trường và hiệu suất tổng hợp β-caroten tăng.