1.1. Giới thiệu về carotenoit và β-caroten
1.3.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM
1.3.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM trên thế giới.
SAM đ−ợc phát hiện năm 1952 ở ý và hiện nay đây vẫn là nơi sản xuất nhiều nhất.
Mặc dù đã đ−ợc nghiên cứu rất kỹ nh−ng cho đến nay SAM vẫn ch−a phổ biến nhiều vì
giá thành sản xuất quá đắt. Từ năm 1970 một số nước ở Châu Âu như ý, Đức đã kê đơn SAM cho các bệnh nhân trầm cảm và đau xương cơ khớp. Từ cuối những năm 80 đến đàu thập kỷ 90 mới đ−ợc du nhập vào Mỹ, SAM là một trong những dinh d−ỡng bổ sung có tính thời sự nóng hổi nhất trên thị tr−ờng. Không phải là một loài d−ợc thảo, vitamin, hoocmon hay bất kỳ dạng chất dinh d−ỡng nào, SAM là một dạng tổng hợp đ−ợc ổn định của S-adenosylmethionine, một hóa chất đ−ợc sản sinh trong tất cả các loại sinh vật nhân thật. Trong ng−ời SAM cần thiết cho ít nhất 35 quá trình sinhhóa bao gồm cả sự bảo toàn
69 cấu trúc màng tế bào và sản sinh ra những cơ chất quan trọng cho sự dẫn truyền các xung thần kinh tác động lên cảm xúc và trạng thái tình cảm. SAM gia nhập vào thị trường Mỹ với mọi dạng quảng cáo rầm rộ nh− những bài báo giới thiệu rất nhiệt tình ở Newsweek, rất nhiều ch−ơng trình TV, 2 quyển sách ca ngợi SAM, cả trang báo quảng cáo khổ rộng trong nhiều loại tạp chí và một trang web quá đầy đủ về SAM. Dựa trên những kinh nghiệm lâm sàng ở châu Âu và những công trình nghiên cứu khoa học ng−ời ta cho rằng SAM là liệu pháp chữa bệnh rất hiệu quả thật là kỳ diệu cho các bệnh trầm cảm, đau khớp và những bệnh gan. đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới (chủ yếu ở ý và Mỹ) về cơ chế tác dụng của SAM ở các bệnh trên nh−ng ng−ời ta mới chỉ đ−a ra giả
thuyết là chính vì đây hầu hết là những bệnh nan y với nhiều phản ứng hóa sinh phức tạp liên quan đến hệ thần kinh, vận động, tiêu hóa [Wicomb 2005].
Não ng−ời khỏe mạnh sản ra toàn bộ l−ợng SAM cần thiết từ methionine [Baldessarini 1987], nhưng ở những người bị trầm cảm quá trình này bị hỏng, đứt quãng. Khi bổ sung SAM thì l−ợng các chất dẫn truyền thần kinh tăng lên và nhất là sau khi tiêm với liều l−ợng cao một cách có hệ thống thì SAM có tác động tích cực lên hệ thần kinh trung tâm, lên tính mềm dẻo của màng tế bào vì SAM kích thích sự tổng hợp của phospholipid.
Từ mùa xuân năm 1999, hai công ty sản xuất vitamin - GNC, Pharmavite, công ty d−ợc phẩm lớn của Mỹ BASF nhập SAM nguyên liệu từ Châu Âu sau đó đóng gói và bán d−ới nhiều nhãn hiệu khác nhau (Hình 1.3.6). Sản phẩm này nhanh chóng chiếm lĩnh thị trường – nhãn hiệu Pharmavite’s Nature Made đứng thứ 25 giữa 13000 loại thực phẩm bổ sung ở những cửa hàng thuốc, thực phẩm dinh d−ỡng. ở những n−ớc phát triển SAM rất
đắt, một ngày có thể phải tiêu tốn từ 2,5 - 18$ và phải dùng trong thời gian dài thì mới có tác dụng[Cowby và Underwood 1999].
Có một điều quan trọng cần chú ý khi dùng SAM là SAM chuyển hóa thành homocysteine trong cơ thể và dẫn đến mối nguy gây bệnh tim khi homocysteine tích tụ nhiều trong tế bào nh−ng có một tin vui khác là chúng ta có thể không để cho homocysteine tích lại bằng cách dùng bổ sung B complex (đặc biệt B6, B12 và folic acid -
đều là những chất sẵn sàng cho nhóm methyl). Homocysteine đ−ợc nhận nhóm methyl và chuyển thành acid amin methionine cần thiết nh− cũ hoặc chuyển thành chất chống oxy hóa glutathione, do đó những ai muốn dùng SAM phải dùng thêm vit B với chế độ ăn giàu hoa quả và rau [Wincomb 2005].
1.3.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM ở Việt Nam:
ở Việt Nam, ch−a có nghiên cứu nào về SAM, nhóm đề tài KC - 04-27 là những ng−ời thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về tổng hợp, sản xuất thực nghiệm SAM từ các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Natural SAM - 15$ Source natural SAM - 21-25$
Finest SAM -20$
12 viên
SAM 400mg + Vit B - 57 $
Jarrow SAM - 25-37$, 30 viên
Jarrow SAM 200mg - 25 $
Mood plus SAM - 40$
30 viên
Natrol SAM Joint Formula - 15-21 $
Hocks.com Pharmacy SAM - 53,99 $
SAM - 38$ 30 viên Nature’s plus SAM Rx- Mood - 31 $
Mood made triple flex SAM - 18- 20 $ Hình 1.3.6. Một số hình ảnh các nhãn hiệu sản phẩm SAM.
Ch−ơng 2
nguyên vật liệu và ph−ơng pháp
2.1. Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy.
2.1.1. Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp β-caroten.
Hai chủng nấm sợi B. trispora WH1(+) và WH2(-) nhận được từ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Virus học Vũ Hán, Trung Quốc. Chủng B. trispora NBRC 5898 (+) mua từ Sưu tập giống Quốc gia Nhật Bản.
Môi tr−ờng nhân giống và lên men
* Môi tr−ờng PDA cho nhân giống hai chủng WH1 và WH2. Agar: 2.2%
Glucoza: 2%
Khoai t©y: 20%
• Môi tr−ờng PSA cho nhân giống chủng 5989.
Agar: 2.2%
Sacaroza: 2%
Khoai t©y: 20%
pH = 5,6
* Môi tr−ờng lên men cơ bản:
Glucose: 50g/L MgSO4: 0.5g/L
L-asparagine: 2g/L BHT(butylated hydroxytoluen):
0.5g/L
KH2PO4: 1.5g/L Dầu đậu t−ơng: 50g/L Ph−ơng pháp giữ giống, nhân giống B. trispora:
* Ph−ơng pháp giữ giống: Bào tử của các chủng giống nuôi trên môi tr−ờng thạch nghiêng đến khi bào tử mọc kín bề mặt thạch, lấy bào tử cho vào ống cát vô
trùng, bảo quản ở 40C.
* Ph−ơng pháp nhân giống vào môi tr−ờng lên men: Giống dùng để lên men
đ−ợc nuôi trong bình tam giác 500 ml chứa 50 ml môi truờng thạch - gluco - khoai tây (môi trường PDA) đối với 2 chủng WH1, WH2, môi trường thạch - saccaroza - khoai tây (môi trường PSA) đối với chủng NBRC 5898 (+) ở 280C trong 72-120 giờ đến khi bào tử mọc đen đều trên toàn bộ mặt thạch. Giống tiếp vào môi trường lên men dịch thể là dịch huyền phù bào tử thu đ−ợc khi rửa bào tử với 25 ml n−ớc cất vô trùng.
* Lên men thu sinh khối nấm sợi chứa chất màu đ−ợc thực hiện trong các bình tam giác 500 ml chứa 50 ml môi tr−ờng lên men cơ bản (BM: bao gồm gluco, L- asparagine, muối khoáng, BHT, dầu đậu tuơng, vitamin B1) hoặc môi tr−ờng lên men dịch thể có sử dụng các nguyên liệu thay thế (nguồn cacbon, nitơ, chất hoạt động bề mặt...) lắc tròn 250 vòng/phút ở 280C trong 5 ngày. Các số liệu thu đ−ợc là kết quả
trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Ph−ơng pháp đánh giá hình thái và đếm số l−ợng bào tử nấm:
Hình thái sợi nấm, bào tử túi, bào tử tự do, B. trispora trong quá trình phát triển trên thạch PDA, PSA và trong quá trình lên men đ−ợc quan sát, đếm và chụp ảnh trên kính hiển vi quang học Nikon E600.
Ph−ơng pháp xác định hàm ẩm sinh khối sau lên men:
Xác định hàm ẩm trên thiết bị xác định hàm ẩm tự động bằng tia hồng ngoại trên máy Presica HA 60.
2.1.2. Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp MELs:
Các chủng nấm men nhập ngoại: Pseudozyma antarctica NBRC 10736, Pseudozyma aphidis NBRC 10182, Pseudozyma antarctica NBRC 10260; các chủng nÊm men ph©n lËp tõ nem chua: Trichosporonoides sp (Sưu tËp gièng, nhãm Ph©n lËp và sinh học phân tử, Viện CNTP cung cấp); các chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên chứa hàm l−ợng dầu cao nh− lạc, vừng, dừa (tại chợ Hà Nội), đất nhiễm mỡ.
Môi tr−ờng giữ giống: (môi tr−ờng YM agar) Glucose: 10 g
Peptone: 5 g Cao nÊm men: 3 g Cao malt: 3 g Thạch: 15 g N−íc cÊt: 1 L
pH: 5,6
Môi tr−ờng nhân giống: (Kitamoto và cs, 1990) Glucose: 60 g
NaNO3: 2 g Cao nÊm men: 1 g KH2PO4: 0,2 g MgSO4.7H2O: 0,5 g
N−íc cÊt: 1 L
pH: 6,2
Môi tr−ờng lên men: (Kitamoto và cs, 1990) NaNO3: 2 g
Cao nÊm men: 1 g KH2PO4: 0,2 g MgSO4.7H2O: 0,5 g N−íc cÊt: 920 mL DÇu: 80 mL
pH: 6,2
2.1.3. Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp SAM:
Các chủng nấm men Saccharomyces sử dụng cho nghiên cứu tổng hợp SAM bao gồm 4 chủng trong sưu tập giống nấm men, Viện Công nghiệp thực phẩm, là các chủng đ−ợc sử dụng trong sản xuất bia, cồn và 3 chủng mua từ Nhật Bản là S.
cerevisiae IFO 2343, 2346, 2347, đó là các chủng đ−ợc sử dụng trong sản xuất r−ợu sake.
Giống nấm men đ−ợc giữ trong parafin ở 40C khi cần sẽ hoạt hóa và phân lập lại.
Đây là bước chuẩn bị giống rất quan trọng để lên men có kết quả tốt.
Môi trường hoạt hóa: sau một thời gian giữ ở nhiệt độ thấp và ở trạng thái rất hạn chế hoạt động tế bào nấm men cần đ−ợc hoạt hóa để đ−ợc đánh thức và làm quen dần với môi tr−ờng mới. Nuôi hoạt hóa trong 24 h ở 280C.
Môi tr−ờng hoạt hóa nấm men:
Glucose 50 g/l Việt nam
Polypeptone 5 g/l Trung quèc
KH2PO4 4 g/l Trung quèc
K2HPO4 0,2 g/l Trung quèc
MgSO4.7H2O 0,2 g/l Trung quèc
Cao nÊm men (yeast extract) 2 g/l India Chỉnh pH của môi trường đến giá trị 6.
Môi trường thạch đổ hộp lồng: sau khi chọn được ống giống hoạt hóa không nhiễm, phát triển tốt tiến hành cấy ra hộp lồng dùng que cấy ria, nuôi ở 280C trong 2 ngày khi quan sát thấy khuẩn lạc lên đều đẹp thì lấy ra. Có thể bảo quản hộp lồng ở nhiệt độ thấp để dùng dần. Môi trường thạch đổ hộp lồng có thành phần như môi tr−ờng hoạt hóa thêm agar 22 g/l, pH=6.
Môi trường thạch nghiêng: chọn khuẩn lạc riêng rẽ tròn đều, to vừa, đẹp cấy lên ống thạch nghiêng. Môi tr−ờng thạch nghiêng có thành phần giống nh− môi tr−ờng
thạch đổ hộp lồng. Nuôi trong 2-3 ngày ở 280C khi giống nấm men mọc lên đều đẹp theo đ−ờng cấy trên mặt thạch thì cất ở 40C dùng dần. Sau 1 tháng cấy chuyền ra ống thạch mới để tránh bị già giống và thiếu dinh d−ỡng.
Môi tr−ờng nhân giống:
Các b−ớc nhân giống có tỷ lệ 10%. Nhân giống cấp 1 với 1 vòng que cấy trong 10 ml môi tr−ờng nhân giống, nuôi trong 1 ngày ở 280C trên máy lắc điều nhiệt Orbital Incubator Shaker gyromaxTM 737, Amerex Instruments, Inc. Nh©n gièng cÊp 2 víi 10 ml giống cấp 1 trong 100 ml môi trường nhân giống cứ như thế cho đến khi đủ lượng giống cần thiết. Môi tr−ờng nhân giống có thành phần giống nh− môi tr−ờng hoạt hóa.
Lượng giống sau khi đã được nhân đủ được tiếp vào môi trường lên men với tỷ lệ từ 5- 10%.
Môi tr−ờng lên men cơ bản:
Các thành phần của môi tr−ờng lên men cơ bản nh− sau:
Sucrose 100 g/l Việt nam
Cao nÊm men (yeast extract) 10 g/l India KH2PO4 4 g/l Trung quèc MgSO4.7H2O 0,1 g/l Trung quèc Urea 15 g/l Trung quèc L-methionine 7,5 g/l Merk, Đức CaCl2.2H2O 0,2 g/l Trung quèc ZnSO4. 7H2O 2,5 mg/l Trung quèc FeSO4. 7H2O 2,5 mg/l Trung quèc FeSO4. 7H2O 2,5 mg/l Trung quèc Cu SO4. 5H2O 20 mg/l Trung quèc H3BO3 20 mg/l Trung quèc
CoCl2.6H2O 2 mg/l Trung quèc
KI 10 mg/l Trung quèc
Chỉnh pH môi tr−ờng lên giá trị 6 [Shiozaki và cs 1985]
Lên men ở 28oC, 72 giờ, lắc 200 vòng/phút. Nuôi cấy trong thiết bị lên men 14 lít với môi tr−ờng lên men nh− trên, khuấy 200 - 350 vòng/phút, sục khí 0,5 - 0,7 lít không khí/lít môi tr−ờng/phút, thời gian 48 - 66 giờ.
Cần tuân thủ nghiêm ngặt các nguyên tắc vô trùng trong công nghệ vi sinh. Tất cả
các dụng cụ đều được hấp vô trùng ở 1270C, 60 phút trước khi tiếp môi trường. Khi có chứa đường đơn thì môi trường được hấp vô trùng ở chế độ 1150C, 30 phút để tránh bị cháy. Các loại môi tr−ờng khác đ−ợc hấp vô trùng ở 1210C, 20 phút.
Xác định động học quá trình phát triển và tổng hợp SAM của nấm men: lấy mẫu cách 4 hoặc 6 giờ, xác định sự phát triển, sinh trưởng và sự tổng hợp SAM theo thời
gian nuôi cấy trên máy lắc và trên thiết bị lên men 14 lít. Trên thiết bị lên men 14 lít (Bioflo 110, New Brunswick Scientific Company, USA), ngoài các chỉ số về sinh khối và hàm l−ợng SAM, sự thay đổi pH, tiêu thụ ôxy cũng đ−ợc theo dõi trong suốt thời gian lên men.
Sự phát triển của tế bào nấm men được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) tại bước sóng λ = 600 nm và được cân xác định lượng sinh khối ướt trong 100 ml dịch lên men.
Ph−ơng pháp đánh giá hình thái tế bào nấm men: hình thái nấm men trong quá
trình nuôi cấy đ−ợc quan sát, đếm và chụp ảnh trên kính hiển vi quang học Nikon E600.
Các số liệu thu đ−ợc là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
2.1.4. Tổng hợp các thông tin về các chủng giống vi sinh vật nhập ngoại:
Các chủng giống nấm men, nấm sợi đ−ợc mua và sử dụng trong nghiên cứu đ−ợc thống kê trong bảng sau:
Bảng 2.1.1. Tổng hợp các thông tin về các chủng giống vi sinh vật nhập ngoại đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu của đề tài
Stt Tên chủng giống, ký hiệu
Nguồn gốc Ghi chú
1 Blakeslea trispora NBRC No 5989
Sưu tËp gièng Quèc gia Nhật Bản
Mua ngày 4/12/2004 theo Hoá
đơn số 2004000061với các chỉ dẫn công nghệ, điều khoản sử dông kÌm theo
2 Blakeslea trispora WH1
(+) - Chủng đực
Sưu tập giống Viện Virut học Vũ Hán, Vũ Hán, Hồ Bắc,
Trung Quèc
Đ−ợc tặng, do PGS.TS. Yuan Zhiming, Phó Viện tr−ởng đi công tác tại Viện Công nghiệp thực phẩm theo đề tài Nghị định th− Việt Nam – Trung quốc (2004-2005) Mã số: 5-308 J 3 Blakeslea trispora WH2
(-) - Chủng cái
Nh− trên Nh− trên
4 Pseudozyma antarctica NBRC No 10260
Sưu tËp gièng Quèc gia Nhật Bản
Mua ngày 4/12/2004 theo Hoá
đơn số 2004000061với các chỉ dẫn công nghệ, điều khoản sử dông kÌm theo
5 Pseudozyma antarctica Nh− trên Nh− trên
NBRC No 10736 6 Pseudozyma aphidis
NBRC No 10182
Nh− trên Nh− trên
7 Saccharomyces cerevisiae NBRC No 2346. Tên cũ trên ống
đông khô là S.
cerevisiae IFO No 2346
Sưu tËp gièng Quèc gia Nhật Bản
Mua ngày 27/10/2003 theo Hoá
đơn số 2003-1348 với các chỉ dẫn công nghệ, điều khoản sử dông kÌm theo
8 Saccharomyces cerevisiae NBRC No 2346. Tên cũ trên ống
đông khô là S.
cerevisiae IFO No 2346
Nh− trên Nh− trên
9 Saccharomyces cerevisiae NBRC No 2346. Tên cũ trên ống
đông khô là S.
cerevisiae IFO No 2346
Nh− trên Nh− trên
Ghi chú: IFO: Institute For Fermentation Osaka, Japan, WH: Vũ Hán.
NBRC: National Biological Resource Center, Japan
2.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu:
2.2.1. Các ph−ơng pháp xử lý dịch lên men, tách chiết sinh khối nấm sợi, phân tích và tạo sản phẩm chất màu β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora.
Ph−ơng pháp A: Dịch lên men đ−ợc đun lên 100oC trong 15, 30 và 60 phút hoặc hấp ở 121oC trong 15 phút. Dịch sau xử lý nhiệt ly tâm thu sinh khối và tách chiết trực tiếp bằng dung môi (Rouska và Mantzouridou 2001).
Ph−ơng pháp B: Dịch lên men sau khi xử lý nhiệt và đ−ợc ly tâm ở 5000 v/ph trong 20 phút. Sinh khối rửa bằng nước cất đến khi dịch trong không còn mầu nữa,
đồng hoá bằng áp lực trong 5, 10, 15 phút sau đó chiết tách β-caroten bằng dung môi.
Ph−ơng pháp C: Dịch lên men, ly tâm 500v/phút trong 20 phút, rửa sạch bằng nước cất thu sinh khối đem sấy ở 400C/24giờ sau đó tiến hành chiết bằng dung môi.
Tách chiết β- caroten bằng l−u chất siêu tới hạn SC – CO2
Quá trình tách chiết đ−ợc tiến hành trên thiết bị SFT-250 (Rui và cs 2003).
Nguyên lý hoạt động:
Bình chứa CO2 lỏng (99,9%) đ−ợc cấu tạo đặc biệt để có thể chuyển thẳng CO2 ở dạng lỏng vào bơm mà không chuyển sang trạng thái khí. Quá trình này giúp tiết kiệm năng lượng hơn. Dòng CO2 lỏng được đưa qua van 2 điều chỉnh lưu lượng trước khi vào bộ phận trao đổi nhiệt.
Ph−ơng pháp tinh sạch dịch chiết β-caroten:
Ph−ơng pháp thu hồi dịch β-caroten và dung môi:
Cô đặc dịch tinh sạch β-caroten và thu hồi dung môi trên máy cô quay chân chông IKA FV100 ở áp suất thường 1at với các thang nhiệt độ theo từng dung môi hoặc ở 400C với các áp suất chân không tuỳ theo từng loại dung môi nh− bảng 2.1.2.
Bảng 2.1.2. Bảng tra áp suất nhiệt độ bay hơi của các dung môi Nhiệt độ bay hơi (0C)
P (mbar)
n-Hexan Aceton Cồn 1013 69 56 75
335 40
556 40 175 40
2.2.2. Các ph−ơng pháp thu nhận, tách chiết, phân tích và tạo sản phẩm MELs tõ nÊm men Pseudozyma.
Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch môi tr−ờng nuôi cấy đ−ợc lấy ra đem tách chiết bằng Tert Butyl methyl este (TBME). Một l−ợng dịch lên men và TBME với thể tích tương đương nhau được đổ vào bình chiết, lắc mạnh. Để yên hỗn dịch đó trong một khoảng thời gian nhất định để phân thành hai lớp. Lớp trên bao gồm sản phẩm và TBME. Lớp d−ới bao gồm sinh khối và canh tr−ờng. Đem lớp trên đi cô quay chân không thu đ−ợc sản phẩm cô đặc thô (Spoekner và cs, 1999).
2.2.3. Các ph−ơng pháp thu nhận, tách chiết, phân tích và tạo sản phẩm chứa SAM tõ nÊm men Saccharomyces.
2.2.3.1. Ph−ơng pháp trích ly SAM bằng dung môi:
Trích ly SAM bằng perchloric acid: SAM đ−ợc trích ly khỏi sinh khối tế bào theo các b−ớc nh− sau:
- Ly tâm thu sinh khối ở nhiệt độ 4oC hoặc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút, 5.000 - 10.000 vòng/phút.
- Cặn tế bào đ−ợc rửa 2 - 3 lần bằng n−ớc muối sinh lý.
- Hòa cặn trong 2 thể tích dung dịch perchloric acid - PCA (HClO4) 1,5 N và lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
- Ly tâm tách xác tế bào thu đ−ợc dịch trong chứa SAM.
- Chỉnh pH đến 4,5 bằng KHCO3.
- Ly tâm tách kết tủa KClO3, thu đ−ợc dịch trong chứa SAM đ−a đi phân tích
định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và phân tích định lượng bằng phương pháp quang phổ [Shiozaki và cs 1985, Shapiro và Ehninger 1965, Schlenk và DePalma 1957].
Trích ly SAM bằng acetic acid: Hòa cặn tế bào nấm men trong 4 thể tích dung dịch acetic acid 10% và lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm tách xác tế bào thu
đ−ợc dịch trong chứa SAM, chỉnh pH đến 4,5 bằng hạt nhựa trao đổi ion OH -. Dịch trong chứa SAM đ−ợc phân tích bằng ph−ơng pháp quang phổ và sắc ký bản mỏng [Shiozaki và cs 1985].
Trích ly SAM bằng ethyl acetate: Thêm hỗn hợp ethyl acetate và n−ớc (tỷ lệ 1:1) vào sinh khối −ớt của tế bào nấm men với tỷ lệ 1:5 và lắc mạnh trong 30 phút ở nhiệt
độ phòng. Sau đó cho thêm dung dịch H2SO4 nồng độ 0,35N với tỷ lệ 1: 2 so với sinh khối −ớt và lắc tiếp 1,5 giờ. Ly tâm tách xác tế bào và dùng n−ớc rửa cặn tế bào 2 - 3 lần cho đến khi tách hết SAM (kiểm tra mẫu bằng thiết bị quang phổ ở bước sóng λ = 260 nm).
Ph−ơng pháp trích ly SAM bằng sốc nhiệt: Thêm n−ớc cất vào sinh khối −ớt với tỷ lệ 3:1 hoặc 4:1, khuấy đều sau đó giữ ở nhiệt độ -70oC trong 48 giờ. Làm tan đá ở nhiệt độ phòng. Ly tâm tách cạn tế bào và dùng nước cất rửa cặn tế bào 2-3 lần đến khi tách hết SAM [Shiozaki và cs 1986].
2.2.3.2. Ph−ơng pháp làm sạch SAM:
Dùng cột trao đổi ion acid yếu dạng Na+
Nguyên tắc: dựa trên nguyên tắc hấp phụ và giải hấp đặc tr−ng của các chất điện li lên mạng hạt gel ionit mà chúng ta có thể tách riêng từng cấu tử trong hỗn hợp sau khi giải hấp.
Các cột sắc ký thủy tinh có đường kính 1 cm được nhồi hạt nhựa trao đổi ion dương Dowex 50 (Mỹ) với lượng 5cm chiều cao và qua các bước chuẩn bị như sau để biến các hạt nhựa thành dạng Na+ cần thiết.
B−ớc 1: Hoạt hóa cột đ−ợc thực hiện nh− sau:
- Rửa cột với khoảng 100 ml H2SO4 6 N - 50 ml n−ớc tiếp theo rửa sạch acid
- Hoạt hóa cột chuyển sang dạng Na+ bằng 300 ml 4 M NaCl - Cân bằng cột với 50 ml 0,1 M NaCl
Vận tốc dòng trong b−ớc này là 2 ml/min B−ớc 2: Nạp mẫu