3. Nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm và ứng dụng S- adenosyl L-methionil (SAM) tõ nÊm men
3.3. Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng S-adeno syl L – methionil (SAM) tõ nÊm men Saccharomyces cerevisiae
3.3.3. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích và tạo các sản phẩm chứa SAM từ nấm men quy mô phòng TN và x−ởng TN
SAM đ−ợc tách chiết hoàn toàn khỏi sinh khối tế bào nấm men bằng perchloric acid.
Sử dụng các dung môi tách chiết khác nh− acetic acid, ethyl acetate và ph−ơng pháp sốc nhiệt cho hiệu suất t−ơng ứng là 70, 95 và 81% so với tách chiết bằng perchloric acid.
Dịch trích ly chứa SAM sau đó đ−ợc làm sạch bằng cột trao đổi ion acid yếu dạng Na+ (Dowex 50, USA) trong PTN và sử dụng thiết bị FPLC quy mô lớn để tinh sạch SAM có nhiều thuận lợi hơn so với cột sắc ký trao đổi ion thông thường như trên. Cột được nhồi
hạt Q-Sepharose FF là hạt trao đổi ion âm, rất mịn để có đ−ợc độ phân giải cao. Hiệu suất tinh sạch và tách chiết đ−ợc trình bày trong bảng 3.3.5.
Bảng 3.3.5. Hiệu quả của các ph−ơng pháp tách chiết và tinh sạch SAM từ sinh khối tế bào nấm men
Quá trình tách chiết Quá trình làm sạch Dung môi và ph−ơng pháp tách
chiết, tinh sạch Hàm l−ợng SAM (g/L)
Hiệu suất thu hồi (%)
Hàm l−ợng SAM (g/L)
Hiệu suất thu hồi (%) Perchloric acid 1,5 N; Nhiệt
độ phòng; 1 giờ
1,70 100 1,45 85 Acetic acid 10%; Nhiệt độ
phòng, 1 giờ
1,15 70 0,90 53 Ethyl acetate + H2O (1:1) ;
0,35 N axít H2SO4, nhiệt độ phòng
1,60 95 1,45 85
4 thÓ tÝch n−íc; - 70oC, 48 giê;
Làm tan đá ở nhiệt độ phòng.
1,40 81 1,20 71 Sau tinh sạch bằng hệ thống
FPLC AKTA prime
- - 1,8-2,3 80
Kết quả sắc ký đồ HPLC phân tích SAM cho thấy với các phương pháp trích ly, tinh sạch đã được nghiên cứu ở trên, chúng tôi đã thu được dịch chứa SAM tinh khiết tương
đ−ơng với mẫu S-adenosyl-L-methionine chuẩn.
Nghiên cứu thu hồi và tạo sản phẩm SAM từ nấm men Saccharomyces.
Sinh khối nấm men giàu SAM đ−ợc trộn đều với một trong các loại phụ gia khác nhau sau để tạo nên tác dụng làm bền cho sản phẩm nh− MgSO4, MgCl2, CaCl2 và chitosan;
các chất này đều đ−ợc chấp nhận dùng trong d−ợc học. Số liệu từ Bảng 3.3.6. cho thấy nồng độ amino acid tổng cao nhất trong mẫu đ−ợc làm bền với MgCl2. Mẫu đ−ợc trộn với MgSO4 giữ đ−ợc hàm l−ợng SAM cao nhất. Sau 6 tháng bảo quản, bột nấm men hầu nh−
vẫn giữ nguyên hàm l−ợng từ 8,4-10,3% ở nhiệt độ phòng.
Bảng 3.3.6. Tác dụng của các ph−ơng pháp xử lý lên bột nấm men giàu SAM No Mẫu xử lý với các loại phụ
gia khác nhau
Hàm l−ợng amino acid tổng (%)
Hàm l−ợng methionine (%)
Hàm l−ợng SAM
(%)
1 MgSO4.7H2O 34,709 1,965 10,35
2 MgCl2.2H2O 38,428 1,944 9,68
3 CaCl2.2H2O 32,500 1,772 8,40
4 Chitosan + MgSO4.7H2O 29,030 1,225 8,80
Nghiên cứu tạo chế phẩm chứa SAM tinh khiết.
Sau tinh sạch bằng FPLC, dung dịch chứa SAM đ−ợc xử lý với hỗn hợp acetone : ethanol để kết tủa lấy SAM tinh khiết. Kết tủa này cũng đ−ợc xử lý bền với một trong các loại muối sau MgSO4, MgCl2 hoặc CaCl2 sau đó đ−ợc đ−a đi đông khô. Kết quả cho thấy MgSO4 có tác dụng tốt nhất bảo vệ sản phẩm. Sau 2 tháng ở nhiệt độ phòng hàm l−ợng SAM 30-33% với độ tinh sạch 92-95% gần nh− không thay đổi.
Bảng 3.3.7. ảnh hưởng của các chất làm bền đến thành phần và chất lượng chế phẩm chứa SAM tinh khiết.
Stt Mẫu xử lý với các loại phụ gia làm bền khác nhau
Hàm l−ợng SAM (%)
Mức độ tinh sạch (%)
1 MgSO4.7H2O 33 95
2 MgCl2.2H2O 32 94
3 CaCl2.2H2O 30 92
Bột nấm men giàu SAM và chế phẩm chứa SAM tinh sạch đ−ợc nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất các loại thực phẩm chức năng nh− bánh kem xốp, bánh khảo hay l−ơng khô … bột này đ−ợc thêm vào ở những công đoạn không gia nhiệt để tránh SAM bị phân hủy. Chúng tôi cũng thử nghiệm đóng viên nang 500 mg cùng với một số loại vitamin B, C tạo thành một loại thực phẩm chức năng giàu các hợp chất dinh d−ỡng vi l−ợng cần thiết. Sản phẩm đã đ−ợc chào bán thử tại Hội chợ Triển lãm quốc tế Thực phẩm - Đồ uống - Thuỷ sản, Hà Nội, 5-9/1/2006. Chúng tôi hy vọng rằng trong t−ơng lai không xa sẽ xuất hiện trên thị tr−ờng loại thức ăn bổ sung chứa SAM này.
3.3.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm chứa SAM từ nấm men S.
cerevisiae quy mô x−ởng TN trên các hệ thống thiết bị lên men 500 và 1500 lít.
Trên cơ sở nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đã hoàn thiện công nghệ và
đ−a ra qui trình công nghệ sản xuất các chế phẩm chứa SAM từ nấm men S. cerevisiae trên thiết bị lên men 1500 lít và mô tả chi tiết 15 b−ớc nh− sau:
1. Chủng giống nấm men Saccharomyces: Giữ giống trên môi tr−ờng thạch nghiêng, nuôi 28oC, thời gian 48 giờ. Bảo quản d−ới lớp dầu parafin lỏng vô trùng,
định kỳ 6 tháng cấy truyền, bảo quản, kiểm tra hoạt tính 1 lần.
2. Nhân giống các cấp: Trên máy lắc 200 v/ph, 28oC, 24 giờ. Tỷ lệ giống7-10%.
3. Lên men trên thiết bị 1500 lít: Nhiệt độ: 28oC, pH môi trường = 6,0, Tiếp methionine 3 lần. Khuấy 100-250 vòng/phút. Sục khí 0,2 – 1,5 lít/lít/phút.
4. Ly tâm thu hồi, rửa sinh khối nấm men chứa SAM: Sử dụng thiết bị ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 15 phút. Rửa 2 lần bằng n−ớc sạch.
5. Xử lý sinh khối nấm men với các phụ gia làm bền SAM: Trộn sinh khối nấm men sạch với các phụ gia làm bền đ−ợc phép sử dụng làm tá d−ợc nh− MgSO4, MgCl2, CaCl2, Chito san.
6. Đông khô: Sử dụng thiết bị đông khô hoặc sấy lạnh đông, ở nhiệt độ –50 đến – 80oC trong thêi gian 24-30 giê.
7. Sản phẩm bột nấm men giàu SAM: Bột nấm men sau đông khô đ−ợc nghiền mịn. Thành phần: Độ ẩm: 6,66%, Gluxít: 15,0%, Lipit: 2,37%, Protein: 47,96%.
Hàm l−ợng SAM: 8,4-10,3%.
8. Tách chiết SAM từ sinh khối nấm men bằng dung môi hữu cơ: Sử dụng acid perchloric nồng độ 10%, tỷ lệ sinh khối: dung môi (1:4), tách chiết ở nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút có khuấy trộn.
9. Thu dịch trích ly chứa SAM: Thu dịch trích ly chứa SAM bằng thiết bị ly tâm lạnh 10.000 v/ph ở 4oC trong 30 phút.
10. Tách cặn protein từ dịch trích ly chứa SAM: Dịch trích ly chứa SAM đ−ợc giữ
ở nhiệt độ 0oC trong 1 giờ, tách cặn protein bằng phương pháp lắng gạn.
11. Tinh sạch dịch trích ly chứa SAM: Sử dụng thiết bị sắc ký cột phân tích, tinh sạch protein FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) sử dụng nhựa trao đổi ion ©m Q - Sepharo se FF.
12. Kết tủa SAM bằng dung môi: Sử dụng hỗn hợp dung môi hữu cơ acetone:
ethanol để kết tủa SAM từ dịch tinh sạch.
13. Xử lý kết tủa SAM với các phụ gia làm bền: Kết tủa SAM đ−ợc trộn với các phụ gia làm bền đ−ợc phép sử dụng làm tá d−ợc nh− MgSO4, MgCl2, CaCl2.
14. Đông khô: Sử dụng thiết bị đông khô hoặc sấy lạnh đông, ở nhiệt độ từ –50 đến – 80oC trong thêi gian 24-30 giê.
15. Sản phẩm chứa SAM tinh sạch 92-95%: Dạng bột màu trắng chứa 30-33%
SAM có độ tinh sạch 92-95%.