3. Nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm và ứng dụng S- adenosyl L-methionil (SAM) tõ nÊm men
3.2.1. Khảo sát lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính của các chủng giống nâm men sinh tổng hợp chuyển hóa glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs)
Từ 24 chủng nấm men nhập ngoại và phân lập, lưu giữ trong sưu tập giống Viện CNTP đã xác định đ−ợc 3 chủng có khả năng sinh chuyển hoá tạo MELs là Pseudozyma antarctica NBRC 10260, P. antarctica NBRC 10736, P. aphidis NBRC 10182 và P.
aphidis DSM 14930 trong đó chủng P. antarctica NBRC 10736 có khả năng chuyển hoá
MELs cao. Chủng P. aphidis DSM 14930 đã đ−ợc báo cáo là sinh chuyển hoá dầu ăn tạo MELs trong tài liệu nước ngoài (Rau và cs, 2003). Do vậy chủng này cũng là chủng đối chứng để xác định và so sánh khả năng tạo sản phẩm MELs trong dịch canh trường của các chủng nghiên cứu.
Bảng 3.2.1. Đánh giá khả năng chuyển hoá của các chủng nghiên cứu STT Kí hiệu chủng Phát triển trên
môi tr−ờng dầu
Sản phẩm chuyển hoá ngoại bào
1 DSM 14930 Có sự phát triển sinh khèi tèt sau 3 ngày
Glycolipit, tạo 4 vạch bắt mầu nâu đen với α-naphtol, mầu nâu vàng với anis andehit, có giá trị Rf trong khoảng 0,43- 0,68
2 NBRC 10260 Có sự phát triển sinh khèi tèt sau 3 ngày
Glycolipit, tạo 4 vạch bắt mầu nâu đen với α-naphtol, mầu nâu vàng với anis andehit, có giá trị Rf trong khoảng 0,43- 0,68
3 NBCR 10736 Có sự phát triển sinh khèi tèt sau 3 ngày
Glycolipit, tạo 4 vạch bắt mầu nâu đen với α-naphtol, mầu nâu vàng với anis andehit, có giá trị Rf trong khoảng 0,43- 0,68
4 NBCR 10182 Có sự phát triển sinh khèi tèt sau 3 ngày
Glycolipit, tạo 4 vạch bắt mầu nâu đen với α-naphtol, mầu nâu vàng với anis andehit, có giá trị Rf trong khoảng 0,43- 0,68
Để chọn ra đ−ợc chủng có khả năng sản xuất MELs, việc khảo sát hiểu quả sự sinh chuyển hoá dầu béo của 4 chủng đ−ợc tiến hành trên điều kiện máy lắc.
Bảng 3.2.2. Khả năng sinh chuyển hoá tạo MELs của 4 chủng lựa chọn
Tên chủng
Hàm l−ợng chÊt bÐo trong
môi tr−ờng
Thêi gian nuôi cấy
(ngày)
Hiệu suất thu hồi MELs thô
(g/L)
Hệ số chuyển hoá
dÇu :MELs (w/w)
NBRC10182 80ml/l 19 39,4 1.86:1
NBRC 10182 60ml/l 19 17,9 -
NBRC 10736 80ml/l 19 40,4 1.82:1
NBRC 10736 60ml/l 19 16,6 -
NBRC 10260 60ml/l 34 2,3 24:1
DSM 14930 80ml/l 19 38,2 1.92:1
DSM 14930 60ml/l 19 16,8 -
Kết quả cho thấy chủng NBRC 10260 có khả năng chuyển hoá kém nhất (2,3 gram MELs sau 34 ngày). Các chủng còn lại là NBRC 10736, DSM 14930 và NBRC 10182 có khả năng chuyển hoá gần tương tự nhau và đều có khả năng sử dụng là chủng sản xuất.
Tuy nhiên chủng NBRC 10736 có khả năng sinh chuyển hoá cao hơn (40,4 g/L sau 19 ngày). Sau đây chủng NBRC 10736 đ−ợc tiến hành nghiên cứu trong các b−ớc tiếp theo của quy trình sản xuất.
Xác định đặc tính sinh lý sinh hoá của chủng nấm men lựa chọn.
Đây là chủng nấm men sợi, nấm men mũ không hoàn thiện (imperfect basidiomycetous yeast) , nẩy chồi 1 phía. Trên môi trường nước chiết đại mạch nẩy mầm (malt- extract) tạo tế bào dài, tạo bào tử (fusiform blastoconidia) từ đỉnh sợi khuẩn ty, sợi khuẩn ti có vách ngăn.
Đã sử dụng kit API zym (Biomeriux) để xác định hoạt tính của 19 enzym. Đã thu
được kết quả đánh giá bán định lượng (phương pháp cho điểm) và kết quả đánh giá định tính các enzym ngoại bào không cảm ứng của chủng P. antarctica NBRC 10736 trên môi tr−êng nh©n gièng.
Việc xác định hoạt tính các enzym ngoại bào sinh ra trên dịch canh trường cho thấy chủng NBRC 10736 sinh ra các enzym nhóm peptidase, lipase, phosphotase và glycosidase khá rộng. Do vậy chủng NBRC 10736 đ−ợc giải thích về khả năng phát triển nhanh trên nguồn cơ chất khác nhau, đặc biệt là trên môi trường có hàm lượng chất béo cao.
Nghiên cứu điều kiện nâng cao hoạt tính các chủng giống nấm men sinh tổng hợp glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs).
Từ 2 thí nghiệm xác định được hệ số thành phần môi trường Y NaN03/cao nấm men = 1,76 (hay 3g NaNO3 và 1,74 g cao nấm men) để đảm bảo tỷ lệ nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ
thích hợp, tạo điều kiện nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sử dụng hết tại cùng một thời điểm.
Bảng 3.2.3. So sánh về tỷ lệ môi trường NaN03/cao nấm men đối với khả năng tạo MELs
STT
Thành phần nguồn C và N trong môi tr−ờng
(g/L)
Protein sinh khèi tÕ
bào (g/L)
Sản l−ợng MELs đ−ợc tạo ra sau 3 ngày (g/L)
Tốc độ sử dông NO3 (g/L/h)
Tốc độ sử dông cao nÊm men (g/L/h)
Y NaN03/cao nÊm men
1
Glucoza,
NaNO3, cao nÊm men- 30;
3;1
2,8 19 0,107 0,061 1,76
2
Glucoza,
NaNO3, cao nÊm men- 30;
3;2
3,73 25,3 0,148 0,084 1,76