1. Các hợp chất carotenoit
3.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp beta-caroten của
Vơí mục đích là cải thiện và nâng cao khả năng tổng hợp beta-caroten của chủng nấm sợi, nhóm nghiên cứu đã thực hiện các thí nghiệm về xử lý chủng B. trispora WH2 là chủng mang giới tính cái (-) bằng hoá chất đột biến EMS, kết hợp xử lý bằng hoá chất kết hợp chiếu tia tử ngoại, và chỉ chiếu tia tử ngoại. Kết quả nghiên cứu sơ bộ cho thấy chất EMS có khả năng nâng cao khả năng sinh tổng hợp beta-caroten ở chủng cái B. trispora WH2.
3.2.1. Xử lý giống bằng biện pháp chiếu tia tử ngoại
Bằng cách chiếu tia tử ngoại trực tiếp vào giống B. trispora WH2 với các thời gian chiếu khác nhau như 30, 60 và 90 phút, với cường độ chiếu sáng là klux để kiểm tra xem liệu việc chiếu tia UV có ảnh hưởng gì đến hàm lượng beta-caroten không. Số liệu lên men cho thấy việc chiếu tia tử ngoại đã không có tác dụng làm nâng cao khả năng tổng hợp beta-caroten ở tế bào nấm sợi WH2.
M inutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
mAU
-5 0 5 10 15
2.091 Betacrotene 6.965 9.269 12.523
1: 455 nm, 8 nm Beta09 Enz.1.8.05009 Name Retention Time
Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học
Bảng 13: ảnh hưởng của thời gian chiếu tia tử ngoại đến khả năng tổng hợp beta-caroten ở chủng nấm sợi B. trispora WH2
STT Thời gian chiếu tia tử ngoại (phót)
Hàm l−ợng sinh khối khô
(g/l)
Hàm l−ợng beta-caroten
(mg/l)
1 30 22,9 2330
2 60 23,7 2217
3 90 24,0 2340
4 Đối chứng (không chiếu tia) 23,7 2325 3.2.2. Xử lý đột biến chủng B. trisporra WH2 bằng hoá chất đột biến EMS
Kết quả nghiên cứu cho thấy, với l−ợng hoá chất đột biến EMS đ−ợc
đ−a vào dung dung dịch huyền phù của chủng B. trispora WH2 tăng dần từ 30, 60, 90, 100, 150 và 200 ul/1ml dung dịch giống huyền phù (t−ơng đ−ơng với 1 x 107 bào tử), hàm l−ợng beta-caroten đạt cực đại với nồng độ hoá chất EMS
đ−a vào là 200 ul. Tỷ lệ sống sót của bào tử sau xử lý là 10%. Đặc biệt hình thái ngoài của bào tử có sự thay đổi, từ dạng bầu dục sang dạng có khuynh hướng hơi tròn. Bằng phương pháp chụp cắt lớp, nhóm nghiên cứu đã xác định
được kích thước trung bình của bào tử sau xử lý đột biến, khoảng 5,5-5,7 ul so với kích thước của tế bào trước khi xử lý là 6,5 đến 6,7 um
Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học
Hình 24: ảnh chụp bào tử B. trispora WH2 tr−ớc (a) và sau khi xử lý (b) bằng hoá chất EMS trên kính hiển vi điện tử với vật kính 100X
(a) (b)
Hình 25: Kết quả chụp cắt lớp bào tử chủng B. trispora WH2 (a) và MTH2 (b)
(a) (b)
Đặc biệt khi cấy chủng đã xử lý đột biến trên các môi trường PDA, CM17-1 và CM17-1 có bổ sung các chất kháng sinh nh− Lovastatin, Nystatin và Acetoacetanilde với các nồng độ tương ứng là 30, 0,8, và 60 ug/1 ml môi trường. Sau 7 ngày nuôi ở nhiệt độ 280C trong điều kiện không có chiếu sáng, bào tử phát triển tốt trên môi tr−ờng PDA, phát triển bình th−ờng trên môi tr−ờng CM17-1 và môi tr−ờng chọn lọc (môi tr−ờng CM17-1 có bổ sung các chất kháng sinh nh− Lovastatin, Nystatin và Acetoacetanilde). Nh− chúng ta
Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học
đã biết Lovastatin là chất kháng sinh thuộc nhóm các chất kháng cholesterol cao, trong tế bào vi sinh vật thì nó có vai trò làm giảm hàm l−ợng các sterol ví dụ nh− ergosterol. Do đó sinh tổng hợp beta-caroten tuân theo chu trình mevalonat ở tế bào nấm sợi không bị ảnh h−ởng bởi quá trình chuyển hoá từ farnesyl pyrophosphat thành các sterol, do vậy làm tăng hàm l−ợng beta- caroten cao. Các tế bào phát triển trên môi tr−ờng và kháng đ−ợc với lovastatin, khi đó enim HMG-CoA reductase (hydroxy – methyl – glutaryl – CoA reductase) đ−ợc biến đổi và không bị ức chế bởi các sterol. Cũng nh− vậy acetoacetnide là chất ức chế sinh tổng hợp isoprenoit (bao gồm cả sinh tổng hợp sterol). Trái lại, nystatin là chất có tác dụng kích thích tổng hợp acetyl- CoA nên ít nhiều đều có ảnh hưởng tích cực đến khả năng sinh tổng hợp beta- caroten ở tế bào sợi nấm.
Hình 26 : ảnh chụp chủng B. trispora WH2 tr−ớc (a) và sau khi xử lý (b) bằng hoá chất đột biến trên môi trường minimal agar và trên môi trưòng CM17-1
(c), CM17-1 có bổ sung nystatin (d), lovastatin (e) và acetoacetanilde (f)
(a) (b)
Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học
(c) (d)
(e) (f)
Bằng cách cấy lại từ môi tr−ờng CM 17-1 có bổ sung kháng sinh lovastatin sang môi tr−ờng hoạt hoá giống PDA, bào tử phát triển tốt trên môi trường được dùng để lên men trên qui mô máy lắc. Kết quả lên men chủng xử lý đột biến (đ−ợc đặt tên là B. trispora MTH2) cho thấy hàm l−ợng sinh khối khô hầu nh− không có thay đổi đáng kể nào, tuy nhiên hàm l−ợng beta- caroten tăng lên rất cao (4717 mg/l), gấp khoảng 2,02 lần so với đối chứng, với l−ợng EMS bổ sung là 200 ul cho 1 x 107 bào tử. Xử lý giống bằng EMS với liều l−ợng thấp không có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp beta- caroten ở chủng WH2.
Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học