1.1. Giới thiệu về carotenoit và β-caroten
1.3.2. Các ph−ơng pháp tổng hợp SAM
SAM là dẫn xuất của aminoacid và đ−ợc tạo thành khi methionine kết hợp với ATP bằng con đ−ờng tổng hợp hóa học, con đ−ờng enzyme và nhờ vi sinh vật.
1.3.2.1. Tổng hợp SAM bằng con đ−ờng hóa học.
Khi tìm ra con đường tổng hợp SAM bằng phương pháp hóa học người ta khẳng định rằng đây là cách làm đơn giản có thể áp dụng trong công nghiệp và sản phẩm tạo thành có thời hạn bảo quản lâu dài [Deshpande và cs 2003].
Quy trình tổng hợp hóa học bao gồm những b−ớc sau:
1. Tiến hành phản ứng adenosine với thionyl chloride và pyridine ở nhiệt độ trong khoảng từ 30-350C để thu đ−ợc 5’-chloromethyl adenosine hydrochloride.
2. Xử lý L-methionine với sodium metal với sự có mặt của n−ớc và dung dịch ammonia ở nhiệt độ 30-400C và thu đ−ợc dung dịch muối L-homocysteine sodium
3. Ng−ng tụ 5’-chloromethyl adenosine hydrochloride với L-homocysteine khi có mặt nước và potasium iodide ở nhiệt độ 70-800C để thu được S-adenosyl-L-homocysteine (SAH).
4. Đặt SAH vào phản ứng methyl hóa sử dụng trimethylooxonium tetrafluoroborate (TMOTFB) nh− là một nhân tố cho nhóm methyl trong sự có mặt của trifluoroacetic acid (TFA) nh− là một dung môi để thu đ−ợc SAM tinh khiết.
5. SAM tinh khiết thu đ−ợc ở trên cho phản ứng với các loại sulfonic acid để thu đ−ợc các muối bền khác nhau:
- §iÒu chÕ SAM disulphate resorcinol-4,6-disulfonate:
SAM xử lý với dung dịch acid sulfuric loãng và resorcinol-4,6-disulfonic acid hoặc muối sodium thích hợp để thu đ−ợc SAM disulphate resorcinol-4,6-disulfonate hoặc muối sodium của nó. Sản phẩm sau đó đ−ợc sấy phun.
- §iÒu chÕ SAM disulphate catechol-3,5- disulfonate.
SAM thu đ−ợc từ b−ớc 4 xử lý với acid loãng và catechol-3,5- disulfonic acid hoặc muối sodium thích hợp của nó để thu đ−ợc SAM disulphate catechol-3,5- disulfonate hoặc muối sodium của nó. Sản phẩm sau đó đ−ợc sấy phun.
- §iÒu chÕ SAM disulphate phenol-2,4,6-trisulphonate.
T−ơng tự nh− trên SAM đ−ợc xử lý với acid loãng và phenol-2,4,6 trisulphonic acid
để thu đ−ợc SAM disulphate phenol-2,4,6-trisulphonate.
Các tác giả cũng cố gắng thyết phục đây là cách làm dễ dàng và có sản l−ợng cao nh−ng trên thực tế công nghiệp không thể dễ dàng nh− vậy với quá nhiều công đoạn và dùng nhiều loại hóa chất đắt tiền sau phản ứng khó tách đ−ợc thành một chất đơn để dùng trong d−ợc học và hơn nữa các loại hóa chất này cần phải có độ tinh khiết rất cao.
1.3.2. 2. Tổng hợp SAM bằng con đ−ờng enzyme.
Mặc dù tổng hợp SAM bằng con đường enzyme đã được thông báo từ nhiều năm tr−ớc nh−ng vẫn chỉ có một vài báo cáo về những thí nghiệm này. Lý do chính của sự
59 nghèo nàn về số liệu thể hiện ở sự khó khăn để thu được lượng SAM tương ứng với thời gian và nguyên liệu ban đầu tiêu tốn.
Cantoni đã điều chế SAM bằng phản ứng ATP và L-methionine với xúc tác là enzyme gan. đây là phản ứng mô phỏng theo phản ứng tự nhiên trong cơ thể sống:
L-methionine + ATP SAM + 3IP
Enzyme tổng hợp SAM từ gan thỏ qua nhiều b−ớc tinh sạch bằng ammonium sulphate. SAM đ−ợc điều chế bằng cách ủ L-methionine và ATP cùng với enzyme tổng hợp SAM từ gan thỏ ở nhiệt độ 370C trong môi trường khí quyển 95% N2, 5% CO2. MgCl2 và NaHCO3 đ−ợc thêm vào hỗn hợp phản ứng là những cofactor của enzyme. Theo dõi sự hình thành của orthophosphate để biết đ−ợc diễn biến của phản ứng.
Một đơn vị enzyme tổng hợp SAM bằng l−ợng enzyme xúc tác để thu đ−ợc 1àmole SAM trong 30 phút phản ứng ở 370C [Cantoni và Durell1956].
Những bất lợi của phương pháp này là cần phải có men gan đã qua tinh sạch và một l−ợng lớn ATP. Sau phản ứng bị thất thoát nhiều sản phẩm qua quá trình tinh sạch, gây ra bởi các loại alkali và bởi sự hấp phụ lên những khối kết tủa của nguyên liệu thừa cần loại bỏ. Một phần của khó khăn sau này đ−ợc loại bỏ khi dùng reinecke acid để tách SAM nh−ng cũng không thu đ−ợc kết tủa hoàn toàn từ hóa chất này.
Phản ứng enzyme này thoạt nhìn rất đơn giản nh−ng không thể thực hiện đ−ợc vì
enzyme gan không dễ dàng trích ly và chiết tách. Trong cơ thể sống một giây có hàng ngàn phản ứng enzyme có thể xảy ra nh−ng để có đ−ợc một phản ứng enzyme trọn vẹn ngoài cơ thể lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
1.3. 2.3. Tổng hợp SAM bằng vi sinh vật.
Khi các con đ−ờng tổng hợp trên tỏ ra là không thích hợp thì vi sinh vật nh− những nhà máy nhỏ bé giúp chúng ta đạt đ−ợc mục đích. Tuy nhỏ bé nhất trong sinh giới nh−ng năng lực hấp thu và chuyển hóa của vi sinh vật có thể v−ợt xa các sinh vật bậc cao. Năng lực này đã khiến cho nấm men khi được nuôi trong môi trường tổng hợp có bổ sung methionine tạo ra SAM nhờ hệ enzyme phong phú của nó. Schlenk và de Palma đã từng thông báo rằng SAM tích tụ trong sinh khối của nhiều loại nấm men thông th−ờng nh−
Candida utilis, S. cerevisiae khi đ−ợc nuôi trong môi tr−ờng có khá nhiều L-methionine [Schlenk và DePalma 1957]. Kusakabe và đồng nghiệp cũng đã báo cáo rằng SAM đ−ợc tích tụ ở nhiều loại nấm mốc thuộc các chủng Pennicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, v.v… nh−ng sản l−ợng của SAM đạt đ−ợc không cao [Kusakabe và cs 1974, Shiozaki và cs 1984].
1.3.3. Tổng hợp SAM từ nấm men, các yếu tố ảnh h−ởng.
Để nghiên cứu tổng hợp SAM từ vi sinh vật, các công trình khoa học đa số lựa chọn nấm men S. cerevisiae vì tính phổ biến, không độc, dễ dàng nuôi cấy và hơn hết là nó có khả năng tổng hợp SAM với sản l−ợng cao. [Schlenk và DePalma 1957, Shiozaki và cs 1984].
1.3.3.1. Đặc điểm chung về nấm men Saccharomyces.
Đặc điểm về hình thái:
Tế bào nấm men có hình dạng kích th−ớc khác nhau, th−ờng là hình ô van, elip, hình cầu. Kích thước của chúng cũng thay đổi, phụ thuộc vào chủng và điều kiện nuôi cấy.
Trong môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, tế bào khoẻ và có kích thước lớn hơn so với trong môi tr−ờng nghèo dinh d−ỡng.
S. cerevisiae là sinh vật đơn bào, có cấu tạo nhân chuẩn điển hình với kích thước là 4 - 21 àm và 2,5 - 10 àm. Vì vậy, chúng ta có thể quan sát rất rõ hình ảnh tế bào d−ới kính hiển vi quang học [Molano và cs 1980].
Đặc điểm cấu tạo của S. cerevisiae:
Thành tế bào: Có cấu trúc dày khoảng 1,5 - 2,5 àm và vững chắc. Thành tế bào
đ−ợc tạo nên từ polysaccharit - chiếm tới 80% trọng l−ợng khô của thành, protein chiếm 6 - 10% và l−ợng nhỏ lipit, phospholipit chiếm từ 3 - 10%. Polysaccharit ở thành tế bào nấm men chủ yếu là glucan. Ngoài ra, thành tế bào của S.cerevisiae còn chứa mannan. Lớp trong thành còn đ−ợc cấu tạo từ glucan và protein. Thành phần lớp ngoài của thành giúp cho nấm men có khả năng lắng xuống khi quá trình lên men kết thúc [Molano và cs 1980].
Màng nguyên sinh chất: nằm ngay sát bên trong thành tế bào, bao quanh tế bào chất. Màng NSC đ−ợc cấu tạo chủ yếu là lipit và protein, có độ dày khoảng 7,5 - 8 nm.
Chức năng chủ yếu của màng là chủ động điều khiển các chất dinh d−ỡng vào và ra khỏi tế bào. Màng có tính chất bán thấm chỉ cho những chất cần thiết đi qua và thải ra những chất cặn bã.
Nguyên sinh chất: Quan sát d−ới kính hiển vi điện tử cho thấy, nguyên sinh chất ở tế bào nấm men non trong suốt và đồng nhất, còn nguyên sinh chất ở tế bào già xuất hiện nhiều hạt nhỏ và các không bào lớn. Nguyên sinh chất là thành phần chính của tế bào nấm men, có dạng nhũ tương, phân bố đều khắp tế bào, được cấu tạo bởi protein, lipit, lipoit, polysaccharit, muối khoáng và một l−ợng lớn n−ớc. Nguyên sinh chất là môi tr−ờng
61 cần thiết để hoà tan các chất dinh d−ỡng, thực hiện các phản ứng sinh hoá cho hoạt động sống của tế bào.
Trong nguyên sinh chất còn chứa l−ới nội chất và ty thể. Ty thể có cấu tạo đa hình thái (hình cầu, hình ống, hình sợi) và đ−ợc phân bố đều trong tế bào. Ty thể chứa các enzyme hô hấp và phosphoryl hoá, vì vậy ty thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình cung cấp năng l−ợng, ngoài ra còn tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Ty thể đ−ợc cấu tạo từ protein, lipit, chứa một l−ợng nhỏ ARN và ADN nằm ngoài nhân với kích th−ớc 0,3 - 1 àm chiều rộng và 3 àm chiều dài.
Nhân tế bào: Tế bào nấm men chỉ có một nhân duy nhất đ−ợc bao bọc bởi màng nhân, kích th−ớc từ 1- 3 àm. Trên bề mặt của màng nhân có các hạt riboxom. Trong nhân có chứa ADN, ARN và nucleoprotein. Axít nucleic chiếm 10% trọng l−ợng khô của tế bào. ở S. cerevisiae, ADN nhân có chiều dài 2 àm và có cấu trúc vòng t−ơng tự nh− ở vi khuẩn gọi là “ 2 àm plasmid”. Nhân có chức năng quyết định tính di truyền và điều khiển mọi hoạt động của tế bào. Thành phần chính của nhân là các nhiễm sắc thể mà tạo thành hệ thống cơ bản và duy nhất để tổng hợp ADN, ARN của tế bào.
Không bào: Có hình tròn, đ−ợc bao bọc bởi một lớp màng mỏng. Bên trong lớp màng là dịch bào - chứa phần lớn các chất điện phân trong n−ớc, protein, chất béo dạng hạt, cácbon dạng keo và hệ thống enzyme. Không bào cũng là nơi mà SAM đ−ợc tổng hợp và tích luỹ.
Sinh sản của nấm men S.cerevisiae.
Nấm men có thể sinh sản theo 2 hình thức là nảy chồi và tạo bào tử tuỳ thuộc vào
điều kiện sống. Trong điều kiện môi trường sống bình thường, dinh dưỡng đầy đủ và thích hợp, nấm men sinh sản bằng ph−ơng pháp nảy chồi. Chồi mọc trên bề mặt tế bào mẹ và lớn dần. Chồi chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển. Khi chồi đạt được kích thước phù hợp và các chất trong nó đã đầy đủ như một tế bào nấm men bình thường, chồi sẽ tách ra khỏi tế bào mẹ hình thành một tế bào mới để bắt
đầu một cuộc sống độc lập. Thông thường, mỗi tế bào mẹ chỉ hình thành một chồi nên hình thức sinh sản này còn đ−ợc gọi là hình thức nhân đôi tế bào. Tuy nhiên, khi gặp điều kiện sống không thuận lợi, nấm men có thể sinh sản theo ph−ơng pháp tạo bào tử. Khả
năng sinh sản của nấm men giữ một vai trò quan trọng trong quá trình lên men r−ợu. Khả
năng sinh sản có tốt thì chúng ta mới nhanh chóng gây đ−ợc một l−ợng giống cần thiết trong quá trình lên men [Molano và cs 1980].
Sinh trưởng của nấm men: Nấm men sinh trưởng nhanh trong điều kiện nhiệt độ tối
ưu 28-30oC. S. cerevisiae có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản và có thể sinh trưởng tốt trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí. Trong quá trình sinh tr−ởng, nấm men có thể lấy năng l−ợng từ nguồn hydratcacbon và tạo thành các sản phẩm hữu ích phục vụ cuộc sống con ng−ời nh− r−ợu, ethanol, các enzyme và các chất có hoạt tính sinh học.
1.3.3.2. ứng dụng của nấm men S. cerevisiae
Trong suốt nhiều thế kỷ qua, nấm men đ−ợc sử dụng vào nhiều mục đích kinh tế khác nhau. Chẳng hạn, người Ai Cập đã biết làm nở bột mì bằng nấm men có trong không khí từ 6000 năm về trước. Thậm chí trước đó, người Sumarian đã khắc lên bảng đá quy trình làm cồn cũng dùng hoạt động sinh học của nấm men đơn bào [Lindegren 1949].
Khi kể đến phạm vi ứng dụng của nấm men, người ta có thể liệt kê một số ngành sản xuÊt sau:
- Công nghiệp sản xuất bánh mỳ.
- Công nghiệp sản xuất cồn, đồ uống alcohol và r−ợu vang.
- Sản xuất các sản phẩm dinh d−ỡng hay thức ăn chăn nuôi hoặc là d−ới dạng tinh khiết hoặc d−ới dạng dịch chiết nấm men sau khi tự phân.
- Sản xuất các phức hệ vitamin đặc biệt là phức hệ vitamin B, axít amin…phục vụ cho d−ợc học và các nghiên cứu về vi sinh vật học.
- Sản xuất axít nucleic, các enzyme và các chất có hoạt tính sinh học khác.
Nấm men có đ−ợc những ứng dụng rộng rãi nh− vậy là do chúng chuyển hoá nhanh chóng và biến đổi có hiệu quả các đường thành cồn và CO2 (chẳng hạn như đường có trong các dịch chiết ngũ cốc, dịch nho, sữa…). Ng−ời ta th−ờng nói rằng nấm men là
“thực vật” đ−ợc nuôi trồng lâu đời nhất. Trong đó, S.cerevisiae có vai trò quyết định chủ yếu đến sản xuất bánh mỳ, sản xuất cồn và có giá trị đặc biệt do có khả năng trao đổi chất hiệu quả trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí. Từ trước đến nay, người ta vẫn dùng nấm men để sản xuất cồn. L−ợng cồn đ−ợc sản xuất hàng năm trên thế giới vuợt hơn 2 triệu tÊn.
Nấm men chứa tới 50% protein, một l−ợng lớn các vitamin (đặc biệt là các vitamin nhóm B) và phức hệ các enzyme khác nhau. Ngoài ra, trong nấm men còn thấy hầu hết các axít amin và các axít amin không thay thế nh− lysine, methionine, tryptophan…Vì
vậy, bổ sung nấm men khô hoặc dịch chiết nấm men vào thức ăn chăn nuôi để làm tăng mùi vị và chất l−ợng của nó. Việc sản xuất nấm men cho thức ăn chăn nuôi ngày càng phát triển, thí dụ cứ 10 bể lên men có năng suất 100.000 tấn nấm men khô trong 1 năm
63 trên diện tích 5000m2 tương ứng với số lượng protein thu được từ 90.000 ha đất cày màu mỡ trồng đậu t−ơng.
Năm 1967 các nhà khoa học đã phát hiện ra một loại plasmid ở tế bào nấm men S.
cerevisiae đ−ợc gọi là “ 2 àm plasmid” có vai trò quan trọng trong các kĩ thuật di truyền [Moleno và cs 1980]. Vì vậy, loài S. cerevisiae hiện đang đ−ợc sử dụng nh− một công cụ
đắc lực để mang các ADN tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của kĩ thuật di truyền.
1.3.3.3. Sinh tổng hợp SAM từ nấm men Saccharomyces:
Theo các nghiên cứu khảo sát về sự tổng hợp SAM, rất nhiều nấm men có khả năng tổng hợp SAM nội bào với nồng độ cao khi chúng được nuôi cấy trong môi trường chứa L-methionine. Có thể thấy rõ con đ−ờng tổng hợp SAM của S. cerevisiae trong hình 1.3.5.
L−ợng SAM đ−ợc tích tụ trong nhiều loài khác nhau, nuôi trên những môi tr−ờng khác nhau chỉ dao động trong khoảng rất nhỏ vì cơ chế điều hòa phiên bản enzyme xúc tác tổng hợp SAM chỉ đủ lượng cần thiết dùng trong tế bào. ở S.cerevisiae người ta phát hiện ra gene đúp SAM1 và SAM2 cùng mã hóa enzyme tổng hợp SAM. Phân tích sự thể hiện của 2 gene SAM trong những điều kiện di truyền khác nhau ng−ời ta thấy rằng SAM1 và SAM2 có sự thể hiện khác nhau. Sự thể hiện của SAM1 đ−ợc điều hòa nh− các gene khác tham gia vào vòng chuyển hóa SAM nh−ng SAM2 có sự thể hiện đặc hiệu hoàn toàn khác.
Cả hai gene đều đ−ợc điều hòa phiên mã bằng sự d− thừa methionine trong môi tr−ờng nuôi cấy nh−ng theo những h−ớng khác nhau. Sự thể hiện của gene SAM2 đ−ợc kích hoạt trong môi trường có dư methionine còn gene SAM1 thì bị ức chế đến vô hoạt.
Chính những nghiên cứu phân tích sâu sắc về sự thể hiện của 2 gene này cùng sự thay đổi hàm lượng methionine trong môi trường và định lượng SAM nội bào trong quá trình phát triển đã đ−a chúng ta đến kết luận là trong tế bào nấm men tồn tại 2 bể chứa SAM khác nhau, mỗi cái đ−ợc đổ đầy với SAM đ−ợc tổng hợp bởi 1 enzyme SAMsynthetase khác nhau. Đây có thể là ph−ơng cách bảo quản SAM trong tự nhiên khi chất này đ−ợc tổng hợp quá nhiều tránh sự phân hủy vì SAM là sản phẩm tổng hợp tốn nhiều năng l−ợng. Vì
thế mà giữa các chủng vi sinh vật tạo SAM thì nấm men có khả năng tích tụ l−ợng SAM cao hơn cả.
Tetrahydropteroyltri-L-glutamate 5-methyltetrahydropteroyltri-L-glutamate
homocystein
H2O ATP
Phosphate Pyrophosphate
S-adenosyl-L-methionine L-methionine
S-adenosylmethionine SAM2 Synthetase
S-adenosylmethionine SAM1 Synthetase
Hình 1.3.5. Quá trình sinh sản và sơ đồ tổng hợp SAM của nấm men S. cerevisiae.
65
Để nâng cao hàm l−ợng SAM đ−ợc tạo thành trong tế bào nấm men thì cả hai gene cần đ−ợc kích thích phiên mã để sản xuất ra nhiều enzyme SAM synthetase phục vụ cho phản ứng hoạt hóa methionine. Giải pháp công nghệ mang lại nhiều hiệu quả là thay đổi nồng độ methionine trong môi trường thì các gene này sẽ làm việc tốt hơn.
Trong quá trình lên men có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối và SAM tạo thành. Trong nhiều nghiên cứu lâu năm của mình Shimizu và đồng nghiệp đã chỉ ra một số yếu tố chính nằm trong thành phần của môi trường lên men tổng hợp có tác động trực tiếp lên kết quả của quá trình thu nhận sinh khối nấm men giàu SAM [Shiozaki và cs 1986].
Nấm men có hệ thống enzyme phong phú và khả năng chuyển hóa nhanh những thành phần có trong môi truờng nuôi cấy qua các con đường trao đổi chất khác nhau. Môi tr−ờng nuôi cấy cần có các nguồn dinh d−ỡng cần thiết cho sự phát triển tối −u nhất của nấm men nh− nguồn nitơ, cácbon, chất hữu cơ và các điều kiện công nghệ lên men (cấp khí, khuấy, nhiệt độ).
ảnh h−ởng của nguồn các bon:
Nguồn các bon trong môi tr−ờng nuôi cấy sử dụng các loại đ−ờng glucose, fructose, sucrose là thích hợp nhất. Trong cùng một điều kiện lên men mỗi loại đ−ờng trên đ−ợc thử ở những nồng độ khác nhau. Người ta nhận thấy nồng độ 10% là thích hợp nhất và giữa những loại đ−ờng trên thì sucrose (10%) là nguồn cacbon thích hợp nhất cho quá
trình tổng hợp sinh khối nấm men và SAM nội bào.
ảnh h−ởng của nguồn nitơ:
ảnh h−ởng của nguồn nitơ lên sự tích tụ SAM đ−ợc theo dõi bằng cách thêm nhiều loại nguồn nitơ hữu cơ với nồng độ cuối cùng là 1% và nguồn nitơ vô cơ (nồng độ cuối cùng là 0,2%) thay cho polypeptone trong môi tr−ờng lên men chứa 10% sucrose. Urea (thanh trùng riêng) đ−ợc chứng minh là hiệu quả nhất với nồng độ thích hợp là 1,8%.
Nhiều nguồn dinh d−ỡng hữu cơ nh− cao nấm men (ở các nồng độ khác nhau) trypton, cao ngô, cao thịt, được thử để theo dõi ảnh hưởng của chúng trong quá trình tích tụ SAM. Những kết quả thu đ−ợc cho thấy rằng cao nấm men có ảnh h−ởng tốt nhất cho quá trình tạo SAM với nồng độ thích hợp là 2%. Lớn hơn nồng độ này quá trình tạo SAM bị ức chế mặc dù sinh khối có thể tăng.
ảnh h−ởng của muối khoáng và nguyên tố vi l−ợng:
Những môi tr−ờng lên men thiếu một trong những muối kim loại sau CaCl2, FeSO4, ZnSO4, MnSO4, CuSO4, CoCl2, H3BO3, KI đối chứng với môi trường có đầy đủ hỗn hợp các kim loại trên trong những mức nồng độ cho phép. Kết quả sau quá trình lên men cho thấy thiếu CaCl2.2H2O gây ra sự suy giảm trong tạo SAM mà phần lớn là do sinh khối giảm. Thiếu ZnSO4.7H2O cũng làm giảm SAM vì vậy trong môi tr−ờng nuôi cấy phải có