Chương 4: Xử lý thống kê trong thẩm định phương pháp phân tích
4.1. Tính đặc hiệu, tính chọn lọc
Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích là khả năng phát hiện rõ ràng một chất cần phân tích với sự có mặt của các thành phần khác trong nền mẫu. Những chất có tính chất tương tự giống với chất phân tích như các đồng phân, tiền chất, chất chuyển hóa có khả năng gây cản trở hoặc gây nhiễu tín hiệu đối với chất cần phân tích.
Một phương pháp phân tích có tính đặc hiệu cao nếu: (i) có tín hiệu đặc trưng rõ ràng khi có mặt chất phân tích (với một lượng đủ nhỏ ở gần giới hạn phát hiện); (ii) Không cho tín hiệu đặc trưng khi không có mặt chất phân tích nhưng có sự tồn tại của các chất gây cản trở như đã đề cập ở trên.
Tùy theo phương pháp phân tích cụ thể mà tính đặc hiệu được xem xét dưới cách tiếp cận khác nhau, nhìn chung có hai nhóm cơ bản: (1) nhóm các phương pháp phổ thông thường như quang phổ, sắc ký,... tính đặc hiệu dựa vào peak tín hiệu; (2) nhóm khối phổ dựa vào mảnh ion đặc trưng (ion sơ cấp, precursor ion) hoặc/và ion thứ cấp (product ion).
Để xác định tính đặc hiệu của phương pháp cần thực hiện các thí nghiệm sau:
(1) Phân tích mẫu trắng: Mẫu trắng cần được phân tích lặp lại ít nhất 6 lần, mẫu trắng là mẫu thực nhưng không có tín hiệu của chất phân tích.
(2) Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn: nồng độ chất phân tích thêm chuẩn ở khoảng giới hạn phát hiện (⁓LOD), có thể sử dụng nhiều hơn một mức nồng độ thêm chuẩn để khẳng định sự đáp ứng của tín hiệu với nồng độ chất phân tích.
(3) Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn các chất cản trở (nếu có).
Đối chiếu các kết quả thu được ta có thể kết luận tính đặc hiệu của phương pháp. Một phương pháp có tính đặc hiệu cao nếu tín hiệu đặc trưng của thí nghiệm (2) là rõ ràng, đồng thời thí nghiệm (1) và (3) không cho tín hiệu của chất phân tích.
Đối với các phương pháp ghép khối phổ, ta vẫn sử dụng các thí nghiệm như trên, tuy nhiên để xem xét độ đặc hiệu của phương pháp cần xét đến số lượng, tín hiệu của mảnh phổ đặc trưng. Mảnh phổ đặc trưng là các ion sơ cấp (precursor fragment) đối với một lần khối phổ và các mảnh phổ thứ cấp (product fragments) đối với phương pháp hai hoặc nhiều lần khối phổ.
Tính đặc hiệu của phương pháp ghép khối phổ thông qua chế độ quét phổ toàn bộ (full scan) hoặc chế độ chọn lọc ion SIM (selective ion mode).
Trong trường hợp quét phổ toàn bộ, tính đặc hiệu của phép phân tích được xác định bởi ít nhất 04 mảnh phổ có cường độ tương đối (relative abundant)
lớn hơn 10% đồng thời 4 ion này phải nằm trong dung sai tối đa cho phép của cường độ tương đối (bảng 4.1).
Bảng 4.1: Dung sai tối đa cho phép của các mảnh ion trong xác định tính đặc hiệu của các phương pháp sắc ký ghép khối phổ.
Mức cường độ tương đối (relative intensity)
Dung sai đối với GC–MS (EI)
GC–MS (CI), GC–MSn LC–MS, LC–MSn
> 50% ± 10% ± 20%
20 % – 50% ± 15% ± 25%
20 % – 50% ± 20% ± 30%
≤ 10% ± 50% ± 50%
Khi chạy chế độ SIM, tính đặc hiệu của phương pháp được xác nhận thông qua số điểm nhận dạng (IP– identification point), số điểm IP càng cao độ chắc chắn trong xem xét tính đặc hiệu càng cao. Số điểm IP là khác nhau trong từng phương pháp sắc ký ghép khối phổ khác nhau như được trình bày trong bảng 4.2 (theo tiêu chuẩn 2002/657/EC).
Bảng 4.2: Số lượng điểm IP tương ứng với các phương pháp sắc ký ghép khối phổ.
Phương pháp MS Số lượng ion Số IP
GC–MS (EI hoặc CI) n n
GC–MS (EI và CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GC–MS (EI hoặc CI) 2 dẫn xuất 2 (dẫn xuất A) + 2 (dẫn xuất B) 4
LC–MS n n
HRMS n 2n
GC–MS/MS 1 ion mẹ hai ion con 4
GC–MS/MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5
LC–MS/MS 1 ion mẹ hai ion con 4
LC–MS/MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5 LC–MS/MS/MS 1 ion mẹ, 1 ion con, 2 ion cháu 5.5
Tùy vào nhóm chất cần phân tích mà số điểm IP yêu cầu tối thiểu là khác nhau. Ví dụ số điểm IP tối thiểu là 4 cho nhóm chất có tác dụng đồng hóa và các chất cấm; số IP tối thiểu là 3 đối với nhóm thuốc thú y và chất gây ô nhiễm (bảng 4.3). Ngoài yêu cầu về số IP tối thiểu thì tỉ lệ tín hiệu của các ion cũng cần được đánh giá. Ít nhất 1 ion có tín hiệu lớn hơn 3 lần so với nền mẫu.
Bảng 4.3: Phân loại nhóm chất theo tiêu chuẩn 96/23/EC Nhóm A: nhóm chất có tác dụng
đồng hóa và chất cấm, IP ≥ 4
Nhóm B: nhóm chất thuốc thú y và chất gây ô nhiễm, IP ≥ 3 – Stilbenes, đồng phân, muối và
ester của stilbene – Thuốc kháng giáp – Steroids
– Acid resorcylic, lactones bao gồm zeranol
– Beta–agonists – Nhóm Nitrofuran
– Các chất kháng khuẩn, bao gồm các sulfonamides và quinolone
– Thuốc xổ giun, chống giun bao gồm nitroimidazoles, carbamates và pyrethroids; thuốc an thần, thuốc chống viêm không steroid
– Hợp chất organochlorine bao gồm PCBs
– Hợp chất organophosphorus, độc tố nấm, thuốc nhuộm…
4.1.2. Tính chọn lọc (Selectivity)
Xét về bản chất, tính chọn lọc giống như tính đặc hiệu của phương pháp. Tuy nhiên, tính chọn lọc được sử dụng trong trường hợp phân tích đồng thời nhiều chất. Trong trường hợp phương pháp có dùng chất nội chuẩn, một phương pháp có tính chọn lọc cao nếu phương pháp đó có khả năng phân biệt rõ ràng đối với một hoặc nhiều chất phân tích, chất nội chuẩn (internal standard, IS) so với các thành phần nội sinh trong nền mẫu hoặc các thành phần khác trong mẫu.