Chương 4: Xử lý thống kê trong thẩm định phương pháp phân tích
4.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (limit of detection, LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của một chất có thể phân tích được. Giá trị này là khác biệt với giá trị 0 (nền mẫu) ở độ tin cậy 99%. Hay nói cách khác, ở giá trị nồng độ chất phân tích bằng LOD ít nhất 99% số lần phân tích cho tín hiệu rõ ràng (positive) hoặc tối đa 10% số lần phân tích không có tín hiệu (false negative).
Khái niệm LOD thường đề cập đến hai khía cạnh: Giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích (method detection limit) viết tắt là MDL và giới hạn phát hiện của thiết bị (instrument detection limit) viết tắt là IDL.
IDL thường gắn liền với một thiết bị cụ thể và được xác định từ dung dịch chuẩn tinh khiết.
MDL là giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích, đây là khái niệm được EPA (Environmental protection agency, USA) định nghĩa cho độ nhạy của một phương pháp phân tích. MDL có giá trị cao hơn so với IDL do ảnh hưởng của các yếu tố như quy trình phân tích, nền mẫu. MDL được sử dụng để công bố giới hạn nồng độ thấp nhất mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được.
LOD/MDL sau khi được xác định bằng thực nghiệm, được sử dụng để công bố giới hạn nồng độ thấp nhất mà một phương pháp có thể phát hiện được.
Giới hạn định lượng của phương pháp (limit of quantitation, LOQ hoặc method quantitation limit, MQL) là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lượng được. Giới hạn định lượng có giá trị bằng 3 lần giới hạn phát hiện của phương pháp.
Với một phương pháp phân tích tiêu chuẩn, phòng thí nghiệm khác nhau sẽ công bố các giới hạn phát hiện khác nhau tuỳ thuộc vào tay nghề của nhân viên, thiết bị và chất lượng của hoá chất, chất chuẩn. Trong trường hợp các yếu tố nêu trên không đảm bảo yêu cầu, giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ tăng lên nhiều lần so với công bố của của phương pháp chuẩn. Do đó, việc xác định và công bố giới hạn phát hiện của phương pháp là cơ sở đánh giá năng lực phân tích của phòng thí nghiệm.
Tùy vào trường hợp cụ thể có thể sử dụng một trong các cách xác định giới hạn phát hiện của phương pháp sau:
– Dựa trên độ lệch chuẩn khi phân tích lặp mẫu trắng;
– Dựa trên độ lệch chuẩn khi phân tích lặp mẫu trắng thêm chuẩn hoặc mẫu thật;
– Dựa trên tỉ lệ tín hiệu/nhiễu nền của phổ (S/N);
– Dựa trên đường hiệu chuẩn;
– Dựa trên độ tin cậy của tín hiệu phân tích.
4.3.1. Tính LOD dựa trên độ lệch chuẩn khi phân tích lặp mẫu trắng LOD được tính theo biểu thức sau:
LOD = C̅0+ 3Sd (4.13)
Trong đó:
– C̅0 là nồng độ trung bình của mẫu trắng, C̅0 được tính từ đường chuẩn dung dịch (đường hiệu chuẩn từ dung môi tinh khiết, không tính đến ảnh hưởng của nền mẫu).
– Sd là độ lệch chuẩn của 10 lần phân tích lặp lại mẫu trắng. Thông thường mẫu trắng không có tín hiệu nên C̅0 = 0, lúc này LOD = 3Sd. 4.3.2. Xác định LOD/MDL bằng phân tích mẫu thêm chuẩn, mẫu thật
Phương pháp xác định LOD/MDL bằng phân tích lặp lại mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu thật. Mẫu thêm chuẩn là mẫu trắng (mẫu không phát hiện chất cần phân tích) được thêm một lượng nhỏ chất phân tích. Phương pháp này được sử dụng phổ biến cho hầu hết các phương pháp phân tích định lượng. Công thức tính như sau:
LOD = 3Sd (4.14)
Sd là độ lệch chuẩn của ít nhất 10 lần phân tích lặp lại mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu thật.
Nhằm đảm bảo độ chắc chắn khi công bố, giá trị LOD/MDL cần được xác định bằng phân tích lặp ở nồng độ lân cận với MQL. Nồng độ trung bình của mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu thật khi xác định LOD/MDL nằm trong khoảng từ 2 – 10 lần LOD/MDL công bố, tốt nhất thường dùng trong
thực tế là 4 – 10 lần LOD/MDL. MDL thu được là không chắc chắn nếu C̅
quá nhỏ (< 2MDL), trong khi nồng độ C̅ lớn (> 10MDL) chỉ được sử dụng nếu độ thu hồi của phương pháp tại khoảng nồng độ này là quá nhỏ. Độ thu hồi của phương pháp tại nồng độ C̅ = MQL/LOQ phải đạt yêu cầu như quy định chung đối với một phương pháp định lượng.
Ngoài ra, đối với phương pháp khối phổ nhiều lần, LOD/MDL cần được xác nhận lại bằng cách so sánh tỉ lệ tín hiệu của mảnh ion con định lượng (quantitaion fragment) trên ion định tính (confirmation fragment).
Tỉ lệ này tại LOD/MDL không vượt quá ± 30% so với tỉ lệ trung bình ở các mức nồng độ của đường hiệu chuẩn.
Ví dụ 4.2: Để xác định MDL khi phân tích dư lượng hoạt chất thuốc trừ sâu chlorpirifos trong một nền mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khối phổ. Tiến hành phân tích lặp lại 10 lần trên mẫu trắng như bảng sau:
N Mẫu thêm 3 ppb Mẫu thêm 5 ppb
1 3.532 5.887
2 3.027 5.045
3 3.381 5.635
4 2.969 5.595
5 2.896 4.827
6 3.357 4.948
7 2.898 4.830
8 3.048 5.080
9 3.107 5.178
10 3.101 5.168
Tính MDL của phương pháp phân tích trên.
Giải:
Từ bảng kết quả trên, áp dụng công thức tính Sd cho từng trường hợp và tính LOD theo công thức 4.13 ta thu được bảng kết quả:
Thông số Mẫu thêm 3 ppb Mẫu thêm 5 ppb
Sd 0.22 0.36
MDL 0.65 1.09
MQL 2.17 3.64
R = C̅/MDL 4.84 4.78
Kết quả của 2 nồng độ thêm chuẩn đều cho 2 < R <10, do đó các nồng độ đã dùng để xác định các giá trị MDL và MQL đều đạt yêu cầu. MDL của phương pháp này được chọn là giá trị lớn nhất trong 2 trường hợp trên với MDL = 1.09 ppb, có thể công bố là 2 ppb hoặc cao hơn so với giá trị thực nghiệm.
4.3.3. Tính LOD/MDL dựa trên S/N
Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các phương pháp đo phổ dễ dàng xác định được nhiễu nền như sắc ký lỏng, sắc ký khí.
LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu (S) lớn gấp 3 lần nhiễu đường nền (N), ký hiệu là S/N = 3.
Hình 4.2. Tín hiệu và nhiễu nền trong xác định LOD/MDL
Nhiễu đường nền được tính về hai phía của peak, nhiễu nền tốt nhất được lấy tại vị trí có khoảng cách bằng 5 lần chiều rộng chân peak hoặc 10 chiều rộng nửa peak. Nếu lấy nhiễu nền quá gần peak, nhiễu nền có thể bị ảnh hưởng của peak tín hiệu. Hoặc nếu lấy quá xa peak nhiễu không còn là nhiễu của tín hiệu cần phân tích.
Thông thường mẫu được sử dụng để xác định LOD/MDL là mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ rất nhỏ và được làm lặp lại để đảm bảo độ tin cậy của phép xác định.
4.3.4. Tính LOD từ đường hiệu chuẩn
Phương pháp này chỉ áp dụng được khi phương pháp phân tích có xây dựng đường chuẩn. Một cách tổng quát, nếu phương trình đường chuẩn có dạng y = ax + b với a là hệ số góc (slope) thì LOD được tính theo công thức sau:
LOD = 3.3Sd
a (4.15)
Sd là độ lệch chuẩn khi phân tích lặp lại ít nhất 10 lần mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu thực có nồng độ trong khoảng từ 2 – 10 lần LOD.
4.3.5. Xác định LOD/MDL dựa trên độ tin cậy của tín hiệu
Phương pháp này dựa trên yêu cầu về độ tin cậy của LOD/MDL công bố. LOD/MDL là mức nồng độ mà tối thiểu 90% số lần phân tích cho tín hiệu rõ ràng hoặc tối đa 10% số lần phân tích không có tín hiệu (gọi là âm tính giả, false negative). Cần dự kiến trước mức LOD/MDL của phương pháp sau đó tiến hành thí nghiệm phân tích lặp và thống kê số lần false negative. Nếu số lần false negative nhỏ hơn mức tối đa cho phép (10%) thì có thể công bố giá trị dự kiến chính là LOD/MDL của phương pháp phân tích. Giá trị MDL công bố này nên được kiểm tra thêm về tính đặc hiệu và hiệu suất thu hồi nhằm đảm bảo sự chắc chắn.
Phương pháp xác định LOD/MDL dựa trên độ tin cậy thống kê đặc biệt hữu hiệu khi phân tích đồng thời nhiều chất. Ví dụ như phân tích dư lượng của thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm, LOD/MDL dự kiến thường nhỏ hơn hoặc bằng giới hạn dư lượng tối đa MRL (Maximun residue limit) của đa số các hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật, thông thường MRL là 50 μg/kg.