ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN
2.5. Phương pháp biến nạp gen vào thực vật
Genom của thực vật có các phần khác nhau, phần chính nằm ở nhân, một phần nhỏ nằm ở lục lạp và một phần nhỏ nữa nằm ở ti thể. Hầu hết các nghiên cứu chuyển gen đều thử nghiệm việc đưa gen lạ vào bộ gen của nhân. Tuy nhiên, gần đây càng có nhiều quan tâm đối với việc chuyển gen cơ quan tử vì lý do an toàn sinh học. Gen lục nạp được biến nạp ở tảo lục Chlamydomonas (Boynton et al., 1988; Blowers et al., 1989). Chuyển gen ty thể thành công ở nấm men (Butow và Fox, 1990).
2.5.1. Điều kiện cho chuyển gen ở thực vật
Các điều kiện cần thiết cho việc chuyển gen thực vật là yếu tố mang gen cần chuyển (vector), gen cần chuyển, đoạn khởi động (promoter) và đoạn kết thúc (terminator). Vector cần có những bộ phận sau: Một đoạn khởi đầu cho tái bản; một gen chỉ thị chọn lọc để thao tác trong E. coli và một gen chỉ thị khác được khống chế bởi một promoter mạnh của thực vật phục vụ cho việc chọn lọc ở thực vật. Plasmid T-DNA được dùng trong chuyển gen thông qua Agrobacterium được gắn thêm một đoạn khởi đầu, một đôi đoạn nhắc lại của T-DNA biên trái và biên phải trợ giúp cho plasmid được ghép nối vào DNA cây chủ (Horsch & Klee, 1986). Đoạn nhắc lại biên phải bắt buộc phải có (Wang et al., 1984). Trong trường hợp biến nạp gen lục lạp người ta dùng đoạn khởi đầu tái bản của DNA lục lạp nhằm giúp cho gen biến nạp tồn tại trong một thể tái bản độc lập trong lục lạp của tế bào chủ.
Có hai loại promoter dùng cho chuyển gen thực vật, đó là promoter thường trực (constructive promoter) như CaMV 35S hoạt động thường xuyên trong mọi bộ phận, mọi thời điểm và mọi hoàn cảnh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm (Jefferson et al., 1987;
Benfey & Chua 1989; Battraw & Hall, 1990). Đoạn khởi động như vậy rất cần cho những nghiên cứu đầu tiên về cây chuyển gen.
Loại thứ hai là promoter chỉ hoạt động ở từng loại mô, ví dụ như:
ở củ và hạt v.v.; ở từng thời điểm, ví dụ như: khi ra hoa, khi ngủ nghỉ v.v.; và hoàn cảnh nhất định (Kuhlenmeier et al., 1989) như sốc nhiệt (Baumann et al., 1987), ánh sáng (Kuhlenmeier et al., 1989), bị vết thương (Keil, 1990), bị nấm (Schmid et al., 1990). Có nhiều loại promoter như vậy đã được biết đến và cũng có khá
nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện ra những loại promoter với những tính trạng lý thú (Kertbundit & CS, 1991). Promoter thường có cấu trúc khá đồng bộ cho phép nhận được những mức độ thể hiện gen khác nhau thông qua hóan vị và tổ hợp các vùng khác nhau của một promoter. Điều đó thể hiện rất rõ ở promoter CaMV 35S (Benfey & Chua, 1989). Hoạt lực của promoter có thể được tăng cường khi bố trí hai hoặc nhiều promoter nối tiếp hoặc tổ hợp với nhau (Comai et al., 1989). Đoạn kết thúc phiên mã của thực vật thường chứa một tín hiệu polyadenyl hóa (đó là AATAAA; AATTAA hoặc AACCAA (Dean et al., 1986; Joshi, 1987b). Hai đoạn kết thường dùng trong biến nạp thực vật là đọan kết của CaMV 35S và đoạn kết nos. Đuôi polyA có tác dụng bảo vệ các phân tử mRNA bền vững chống lại sự phân hủy (Gallie et al., 1989). Gen chọn lọc giúp cho việc nhận biết thể biến nạp được dễ dàng (Dekeyser et al., 1989).
2.5.2. Các phương pháp biến nạp gen vào thực vật
Có nhiều phưng pháp biến nạp gen áp dụng cho thực vật, tuy nhiên những phương pháp có giá trị thực tiễn quan trong chỉ hạn chế trong hai nhóm phương pháp chính. Đó là (i) biến nạp trực tiếp DNA bằng tác nhân hóa học như polyethylene glycol (PEG), xung điện và súng bắn gen và (ii) biến nạp DNA gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
i) Biến nạp trực tiếp bằng hóa chất
Trong nhiều năm, kỹ thuật chuyển gen thông qua tiếp nhận DNA tinh chế vào tế bào trần là giải pháp kỹ thuật quan trọng của công nghệ gen thực vật. Thuốc lá và hoa mào gà là hai đối tượng được sử dụng đầu tiên cho chuyển gen trực tiếp nhờ tác động của poly-L-ornithine hoặc polyethylene glycol (PEG). Nguyên lý chung của phương pháp là trong điều kiện dung dịch chứa nồng độ PEG phân tử lượng cao (~8000) thì tế bào trần cạnh tranh với PEG các phân tử nước theo nguyên tắc thẩm thấu. Kết quả là tế bào trần mất nước và nhăn nhúm lại. Khi pha loãng và rủa sạch PEG khỏi dung dịch các phân tử nước được tế bào tiếp nhận trở lại các phân tử DNA qua màng nguyên sinh chất. Phương pháp này nhanh, rẻ vì không cần thiết bị, nhưng không xác định được lượng DNA thâm nhập vào tế bào, vì thế rất hay được áp dụng cho những nghiên cứu biểu hiện tạm thời các cấu trúc gen mới.
ii) Biến nạp bằng xung điện (Electroporation)
Thiết bị biến nạp gen bằng xung điện được gọi là Gen Pulser hoạt động trên nguyên tắc khi cho một dòng điện một chiều chạy qua dung dịch tế bào trần các tế bào sẽ sắp xếp thành từng chuỗi từ điện cực dương sang điện cực âm. Khi một dòng điện mạnh chạy qua trong một quãng thời gian vài phần nghìn giây, màng nguyên sinh chất giữa chúng bị đánh thủng thành lỗ (poration tức là khoan lỗ) và làm cho các phân tử DNA mang điện tích âm thâm nhập vào trong tế bào (Hình 2.6). Hiệu quả chuyển gen trực tiếp được tăng lên đáng kể nhờ kỹ thuật xung điện này. Tuy nhiên, phương pháp này cũng thường được áp dụng cho những nghiên cứu nhanh đối với quá trình biểu hiện tạm thời của gen trong tế bào thực vật vì lượng DNA thâm nhập vào tế bào cũng không được xác định chính xác. Mặc dù kỹ thuật này chủ yếu được dùng trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời các gen trong tế bào trần, đã có nhiều cải tiến đối với kỹ thuật này để ứng dụng cho tế bào còn nguyên vẹn thành cellulose (Fromm et al., 1985). Tuy nhiên, để đạt hiệu quả cao tế bào và mô trước khi biến nạp phải được xử lý trước như làm bị thương hoặc xử lý với dung dịch có áp suất thẩm thấu cao hoặc có chứa enzym (macerozyme).
Cũng có nhiều loại mô và tế bào được xác định là có khả năng tiếp nhận gen (khả biến) như phôi non của ngô, lúa và lúa mỳ. Các yếu tố chính tác động lên hiệu quả biến nạp bằng xung điện là:
Cường độ điện trường, diện dung, tính chất ion và nồng độ đệm, thời gian tiền xử lý. Nếu gây vết thương thì cố hạn chế mức độ tiết nuclease khi bị thương. Cũng có thể xử lý nóng đối với mô biến nạp bằng xung điện để nâng cao hiệu quả.
Hiệu quả cuối cùng của biến nạp trực tiếp gen vào tế bào trần phụ thuộc vào hiệu quả chọn lọc dòng mang gen biến nạp và tỷ lệ tái sinh cây từ dòng tế bào chọn được. Những thí nghiệm thời kỳ đầu mới tập trung vào tế bào trần của các cây thuộc họ cà Solanaceae vì chúng dễ tái sinh cây và gen dễ chọn lọc là gen vi khuẩn mã hóa neomycin phosphotransfererase (npt II). Sau đó, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh cây từ tế bào trần đã thành công trên nhiều loài cây khác nhau, kỹ thuật chuyển gen thông qua tế bào trần cũng đã được triển khai có kết quả trên nhiều đố tượng quan trọng như giống lúa Japonica (Cornejo và Meredith, 1985;
Hayashimoto et al., 1990) và Indica (Datta et al.,1992; Peng et al.,
1990), ngô và cỏ chăn nuôi.
iii) Biến nạp bằng máy bắn gen
Klein (1987) là tác giả đầu tiên tiến hành chuyển gen vào tế bào biểu bì của cây hành bằng kỹ thuật bắn gen. Nguyên lý chính của kỹ thuật bắn gen là DNA được bọc ra ngoài các hạt bụi vàng (hoặc Wolfram) kớch thước khoảng 1àm, hạt vàng bọc gen được bắn vào khối mô đặt phía trước luồng đạn nhờ áp lực cao (3.500 psi) của một luồng khí helium (hình 2.7).
Đến nay kỹ thuật bom hạt có nhiều tên gọi khác nhau như : chuyển nạp sinh học (biolistics), bơm vi tiêm (microprojectile bombardement), gia tốc hạt (particle acceleration) nhưng đều có chung một nội dung là bắn gen. Kỹ thuật bắn gen có những ưu điểm chính như sau:
(1) Chuyển được gen cho các khối mô có tổ chức. Ưu điểm này cho phép chọn những loại mô có triển vọng tái sinh cây tốt để chuyển gen.
(2) Hệ thống chuyển gen toàn năng: Về nguyên tắc có thể bắn gen cho bất kỳ loại mô, cơ quan nào và kết quả nhuộm tạm thời khẳng định điều đó, nhưng kết quả tái sinh cây còn phụ thuộc vào loài và loại mô chọn.
(3) Chuyển được gen cho các giống cây trồng có giá trị. Không những áp dụng tốt cho cây mô hình mà ngay cả những giống cây đang phổ biến như: đậu tương, ngô, lúa (Chen et al., 1993; Christou et al., 1991; 1995) v.v. cũng cho phép tiến hành chuyển gen.
iv) Biến nạp gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens Vi khuẩn đất Agrobacterium có hai loài được dùng trong kỹ thuật di truyền, đó là A. tumefaciens và A. rhizogens. Hình 2.8 mô tả tác động gây nên khối u crown gall của A. tumefaciens và gây nên búi rễ của A. rhizogens đối với nhiều loài thực vật mà bản chất của nó là gen của vi khuẩn được chuyển vào tế bào thực vật.
Hiện tượng gen của vi khuẩn đất được chuyển vào tế bào thực vật được coi là hiện tượng chuyển gen tự nhiên. Đoạn gen được chuyển vào thực vật nằm trong một plasmid khổng lồ kích thước trên 400 kb có tên gọi là Ti plasmid. Không phải toàn bộ DNA của Ti plasmid thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ có một đoạn gen nằm giữa biên trái (left border LB) và biên phải (right border RB) của đoạn DNA vận chuyển (transfer DNA, T-DNA) tách khỏi
phân tử Ti và thâm nhập vào tế bào. Hơn thế nữa đoạn T-DNA này còn có khả năng hòa nhập với DNA nhiễm sắc thể và trở thành một bộ phận bền vững trong genom của thực vật.
Hình 2.6: Thiết bị xung điện Gen Pulser của Hãng BioRad (a) dùng cho chuyển gen ở tế bào trần và tế bào vi sinh vật với các loại cuvet có dung tích khác nhau (b) và sơ đồ nguyên lý hoạt động (c)
Hình 2.7: Thiết bị súng bắn gen loại đơn giản, gọn nhưng kém hiệu quả (a), loại đồng bộ do BioRad sản xuất (b) hoạt động trên nguyên tắc gia tốc hạt (c)
Khi các nhà nghiên cứu thành công trong việc sử dụng đoạn T- DNA của plasmid Ti (Bevan et al., 1983; Chan et al., 1992; Horsch và Klee, 1986; Skriver và Mundy, 1990; Wang et al., 1984) để đưa gen thâm nhập vào bộ genom của tế bào thực vật thì việc chuyển gen thông qua Agrobacterium trở thành công cụ rất hữu hiệu trong
công nghệ gen thực vật, kể cả cây một lá mầm (Hiei et al., 1994;
Le et al., 1994; Liu et al., 1992).
Trước hết cần phân biệt rõ hai họ vector dùng trong biến nạp thông qua Agrobacterium tumefaciens:
(1) Vector liên hợp (cointegrate): Là một vector Ti mang một số đoạn chức năng của vector thông thường khác của E. coli. Một vector liên hợp gồm những phần sau: (i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli; (ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; (iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; (iv) Một đoạn khởi đầu của E.coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy thực chất vector liên hợp là một vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật.
So với E.coli thì Agrobacterium không được thích hợp lắm trong các thao tác biến nạp trực tiếp tế bào đông lạnh nhờ CaCl2. Vì vậy, phải dùng một hệ vi khuẩn E.coli mang một số plasmid hỗ trợ như plasmid mob+ có đoạn khởi đầu ColE1 và plasmid tương trợ pHelper có khả vận chuyển loại plasmid mang gen quan tâm GOI vào tế bào Agrobacterium. Hình 2.8 giới thiệu một sơ đồ phối tác các chủng vi khuẩn mang các loại plasmid cần thiết để có được chủng Agrobacterium mang gen cần biến nạp (pVector).
(2) Vector nhị thể (binary): Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau: (i) Vị trí ghép nối đa điểm; (ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động có ở E.coli và A. tumefaciens (ví dụ RK2); (iii) Gen chọn lọc hoạt động ở cả vi khuẩn và thực vật; (iv) có khả năng vận chuyển (như: oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A.
tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v) Đoạn T-DNA biên (border), đặc biệt là đoạn bên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như: Đoạn kích thích vận chuyển T-DNA (T-DNA transfer stimulator sequence = TSS).
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản.
Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên (border) của T-DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển DNA vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biên từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế
bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật.
Cũng đã có các thiết kế plasmid nhị thể dùng cho loài vi khuẩn rhiogens, loài này không gây nên khối u mà gây ra các cấu trúc như rễ, thành từng chùm như túm lông nên được gọi là rễ lông.
Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium, nhưng cũng có thể nuôi cấy vi khuẩn để tách chiết và tinh chế plasmid rối tiến hành biến nạp theo phương thức trực tiếp.
2.5.3. Mục đích chuyển gen vào một số cây trồng ở nước ta
i) Chuyển gen vào cây bông
Hiện nay khó khăn lớn nhất đối với nghề trồng bông là giống năng suất thấp và bị sâu hại rất nghiêm trọng. Một vụ sản xuất kéo dài 4 tháng thường phải phun 16-18 lần thuốc hóa học làm cho giá thành bông hạt tăng đáng kể vượt qua cả giá nhập khẩu. Hơn nữa, do phải sử dụng nhiều thuốc hóa học vấn đề đảm bảo sức khỏe cho người trồng bông trở thành yếu tố hạn chế mở rộng diện tích cây bông. Giống năng suất cao có thể tạo ra bằng con đường lai tạo, nhưng giống kháng sâu thì duy nhất phải chọn con đường chuyển gen. Các gen thuộc nhóm cry đang được sử dụng rộng rãi. Viện Công nghệ sinh học đã tập hợp được các gen trên, thông qua kết hợp với Viện Nghiên cứu và Phát triển Cây bông để tiến hành chuyển gen kháng sâu, gen chịu hạn bằng các phương pháp khác nhau.
ii) Chuyển gen vào cây hoa
Nghề trồng hoa cắt đang góp phần thay đổi cơ cấu cây trồng và tăng thu nhập cho người nông dân. Tuổi thọ của hoa cắt là yếu tố quyết định việc mở rộng thị trường trong và ngoài nước. Tham gia vào quá trình già hóa của hoa làm nở và rụng cánh nhanh là các gen điều khiển sinh tổng hợp ethylen. Các gen antisense của chúng hoạt động theo cơ chế tạo ARN sợi kép không dịch mã thành protein được. Hiện nay, các gen ACO antisense ức chế tạo ethylen đã được phân lập. Cơ chế thứ hai là làm tăng sinh tổng hợp các loại phytohormon thuộc nhóm cytokinin làm cho rau xanh và hoa tươi lâu.
Hiện nay, Viện Công nghệ sinh học đang có trong tay nhóm gen ACO antisense, gen chitinase và gen bar. Các nhóm gen này sẽ được chúng tôi sử dụng để chuyển vào một số loại cây hoa với mục đích làm hoa lâu tàn.
iii) Chuyển gen vào cây trồng rừng
Cây trồng rừng thường bị sâu phá hoại, mặt khác các đối tượng cây thân gỗ vào loại khó nuôi cấy mô, vì vậy cần sớm có những nghiên cứu, dù chỉ là bước đầu để tiếp cận nội dung này. Đối tượng chính được chọn là cây Paulownia vốn là cây đã được nuôi cấy thành công ở nhiều phòng thí nghiệm trong nước. Các gen lựa chọn là gen chỉ thị (GUS, kháng Kanamycin) để tối ưu hệ thống chuyển gen và tiếp đến là các gen kháng côn trùng (cry) và kháng bệnh. Mục đích lớn nhất là tạo được phương pháp chuyển gen ở cây gỗ trồng rừng và tạo được một số dòng chuyển gen có giá trị.
iv) Chuyển gen vào cây lúa
Hiện nay, khá nhiều gen kháng bệnh đã được đưa vào cây trồng lương thực và thực phẩm như: ngô, khoai tây và cải dầu. Lúa là cây trồng lương thực quan trọng số một của nước ta, các giống lúa thuộc hai nhóm quan trọng nhất là lúa hàng hóa và lúa đặc sản chất lượng cao đều bị nhiễm bệnh nặng, nhất là khi chuyển chúng từ phía Nam ra hoặc từ Trung Quốc về: vụ xuân bị đạo ôn và vụ mùa bị bạc lá.
GenXa21 kháng bệnh bạc lá vi khuẩn sẽ được chuyển vào 2-3 giống chọn lọc cho mỗi nhóm nhằm tạo ra tính kháng rộng các giống oryzae (Zhanget al., 1998). Gen GNA chuyển vào giống phía nam để tạo tính kháng rầy nâu (Sudhakar et al., 1998). Các gen CryIA(b,c) sẽ được chuyển vào lúa để tạo tính kháng sâu. Tính chịu hạn và chịu muối được tăng cường thông qua gen P5CS điều khiển sinh tổng hợp prolin.
v) Chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ
Cây đu đủ là loại cây trồng ăn quả khá phổ biến của nhiều quốc gia, tuy nhiên đây cũng là loại cây trồng bị bệnh virus một cách nặng nề. Hầu như 100% các vườn đu đủ đều bị bệnh, sau 2 năm phải hủy và trồng lại sau khi đổi cây trồng 1-2 vụ. Bệnh đốm vòng đu đủ do virus PRSV (Papaya Ring Spot Virus) gây nên. Tính kháng PRSV được tạo nên bởi quá trình chuyển gen CP hoặc gen NiB của PRSV vào cây đu đủ và đã thành công trên nhiều quốc gia