CHUY N GEN VÀO CÂY HOA CÚC
6.3. Chuy)n gen vào cây hoa cúc
6.3.1. Hoàn thi n qui trình nuôi c y mô hoa cúc
�� chuy�n gen thông qua vi khu�n Agrobacterium có th� s�
d�ng t�t c� các b�ph�n c�a cây: m�u r�và thân v.v., tuy nhiên,
��i v�i cây hoa cúc thì lá là m�t ngu�n t� bào tái sinh thích h�p
�� chuy�n gen quan tâm.
�� th�m dò kh�n�ng tái sinh c�a m�u lá, chúng tôi �ã s�d�ng môi trư�ng MS có các t� h�p phytohormon khác nhau, v�i các gi�ng cúc HCV1, HCT1, HCT2, HCD1.
Theo b�ng 6.1 và 6.2 ta th�y t�l�tái sinh cao nh�t��t 92% c�a gi�ng HCT1 là �môi trư�ng có b�sung 1,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA, trong khi � gi�ng HCV1 ��t 92% là môi trư�ng MS có b�
sung 2 mg/l BAP và 1mg/l NAA.
Ch�i �ư�c c�y lên môi trư�ng MS có ch�a NAA 0,1 mg/l ��
t�o r�, r�b�t��u xu�t hi�n sau 7 ngày.
Qua quan sát cho th�y, sau 2 tu�n �� dài r� ��t 3,5-4,5 cm, r�
tr�ng kho�, s� r�trung bình/cây ��t t�5-7 r�. Chúng tôi nh�n th�y
�ây là môi trư�ng thích h�p �� ra r� gi�ng cúc này. Cây hoàn ch�nh �ư�c �ưa ra cát v�i t� l� s�ng là 95-99%. Sau khi b� r� �ã hoàn thi�n, cây �ư�c tr�ng ra ��t v�i t�l�s�ng là 95%.
B�ng 6.1: 7nh h 8ng c9a các t:h;p (NAA và BAP) =>n t?l tái sinh t@ mAu lá giBng HCT1
BAP(mg/l)
NAA(mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0
0,5 - - 92% 55% - 1,0 - - 27% 47% - 1,5 - - - 68% - 2,0 - - - - -
B�ng 6.2: 7nh h 8ng c9a các t:h;p (NAA và BAP) =>n t?l tái sinh t@ mAu lá hoa cúc giBng HCV1
BAP(mg/l)
NAA(mg/l) 1,0 2,0 3,0
0,5 - - -
1,0 - 94% -
1,5 - 24% 48%
2,0 - - 64%
6.3.2. Chuy&n gen thông qua vi khu*n A. tumefaciens
* �nh h��ng c�a ti�n nuôi c�y (TNC) ��n t� l� s�ng c�a m�u sau lây nhi�m
Nh�ng m�u lá non có kích thư�c kho�ng 0,8 x 0,8 cm �ư�c c�y lên môi trư�ng tái sinh R3 v�i th�i gian khác nhau (t�1-3 ngày), th�i gian ti�n nuôi c�y �ư�c gi�i h�n 1-3 ngày vì trong giai �o�n này t� bào phân chia m�nh t�o ra sinh kh�i l�n và chưa bi�t hóa, thu�n l�i cho vi�c chuy�n gen.
Hình 6.2: GiBng cúc thí nghi m:
HCV1 và HCT1 Hình 6.3: Tái sinh chNi trOc ti>p t@mAu lá giBng HCV1
Hình 6.4: Tái sinh chNi trOc ti>p t@mAu lá giBng HCT1
Hình 6.5: Các mAu lá cây hoa cúc bi>n nQp (A) MAu xTlý tiVn nuôi c y, (B) MAu không xTlý tiVn nuôi c y
Th�i gian ti�n nuôi c�y càng dài thì m�u càng kh�e hơn: b�n lá to, dày và x�p hơn. V�i m�u ti�n nuôi c�y 1-2 ngày, khi ti�n hành gây v�t thương m�i và lây nhi�m, t� l� ch�t v�n cao (21-42%, gi�ng HCT1; 23-45% ��i v�i gi�ng HCV1), t�l� ch�t �en m�t c�t lên ��n 25-35% tuy có gi�m hơn so v�i ��i ch�ng (28-61%). K�t qu�t�t nh�t mà chúng tôi thu �ư�c là thí nghi�m có x� lý TNC 3 ngày trư�c khi lây nhi�m v�i t�l�ch�t gi�m còn 10% và t�l�ch�t
�en t�bào m�t c�t ch�còn 7%.
B�ng 6.3: 7nh h 8ng c9a tiVn nuôi c y lên s c sBng c9a mAu sau lây nhiWm giBng HCT1
Công
th�c S�ngày x�lý TNC
T�l�
ch�t (%)
T�l�ch�t
�en m�t c�t (%)
T�l�tái sinh t�m�t c�t (%) 1 1 ngày 42 35 23 2 2 ngày 21 25 51 3 3 ngày 10 7 81
4 XBi ch ng 61 28 90
(Ti�n hành thí nghi�m 100 m�u��i v�i 1 công th�c)
BYng 6.4: 7nh h 8ng c9a tiVn nuôi c y=Bi vZi s c sBng c9a mAu sau lây nhiWm giBng HCV1
Công
th�c S� ngày x�
lý TNC T� l�
ch�t (%) T�l�ch�t�en
m�t c�t (%) T�l�tái sinh t�
m�t c�t (%)
1 1 ngày 45 34 21 2 2 ngày 23 25 52 3 3 ngày 11 5 84
4 XBi ch ng 62 29 9
(Ti�n hành thí nghi�m 100 m�u��i v�i 1 công th�c)
Sau khi x�lý TNC, ti�n hành gây v�t thương m�i và lây nhi�m v�i vi khu�n. Quá trình ��ng nuôi c�y kéo dài 48h v�i s�có m�t c�a Acetosiringone 50 mM như là m�t ch�t d�n d� sinh h�c.
Ch�t này �óng vai trò là ch�t c�m �ng cho các gen Vir ho�t
��ng. Quá trình này di�n ra trong �i�u ki�n pH th�p và �ư�c t�ng cư�ng nh� các opine và monosaccharide. K�t qu� c�a quá trình này là m�t m�ch �ơn c�a T-DNA �ư�c c�t ra t�i hai ��u trình t�vi�n và chuy�n t�vi khu�n sang t�bào th�c v�t v�i��u
5’ �i trư�c. Sau khi �ã qua màng t� bào, �o�n m�ch T �i vào nhân và k�t h�p v�i DNA trong nhân �v� trí ng�u nhiên.
* K�t qu�ch�n l�c và t�o cây hoàn ch�nh
Ch�n l�c: Ch�ng vi khu�n Agrobacterium LBA 4404 AA3 có mang vector là plasmid pART 27 có ch�a gen nptII (Neomycin phosphotransferase II) và gen CryIA(c) (kháng sâu) thay th�m�t ph�n c�a T-DNA. Còn ch�ng vi khu�n Agrobacterium LBA 4404 AA3 có mang vector là plasmid pAnti - ACO 2300 có ch�a gen nptII (Neomycin phosphotransferase II) và gen Anti - ACO (gi� hoa lâu tàn) thay th� m�t ph�n c�a T-DNA. Vì v�y, chúng có th� �ư�c chuy�n vào t� bào lá hoa cúc trong quá trình bi�n n�p. Gen nptII và gen CryIAC, Anti-ACO cùng �ư�c �i�u khi�n b�i promotor CAMV 35S. Promotor này ho�t ��ng t�t trong b� gen th�c v�t. Do v�y, � nh�ng cây �ư�c bi�n n�p n�u bi�u hi�n ki�u hình, nh�ng gen này s�cho các tính tr�ng: m�t là kháng Kanamycin trong môi trư�ng ch�n l�c, hai là gen CryIA(c) t�o ra protein Bt có kh�n�ng kháng l�i m�t s� sâu h�i và gen anti-ACO gi�cho hoa tươi lâu hơn.
Kháng sinh Kanamycin v�i n�ng��50 mg/l �ư�c s�d�ng làm y�u t�ch�n l�c.
Quá trình ch�n l�c �ư�c ti�n hành ��i v�i nh�ng c�m ch�i 18 ngày tu�i. Kháng sinh Kanamycin �c ch� quá trình sinh t�ng h�p protein �th�c v�t cho nên sau 14 ngày �ã xu�t hi�n nhi�u ch�i có bi�u hi�n b�ch t�ng. Sau 35 ngày � lô ��i ch�ng, t� l� b�ch t�ng thu �ư�c là 100%. Nhi�u ch�i bi�n n�p bi�u hi�n rõ tính kháng kháng sinh, ch�i phát tri�n bình thư�ng: thân lá xanh t�t (Hình 6.6 và 6.7). Tính kháng này có �ư�c là do t�bào có th� �ã mang gen ngo�i lai nptII �ư�c �i�u khi�n b�i promoter CAMV35S. Khi promoter ho�t ��ng, gen nptII s� mã hóa cho neomycin phosphotransferase (APH[3’]-II) làm m�t ho�t tính c�a kháng sinh nên cây v�n phát tri�n �ư�c. Tuy nhiên, th�c v�t �ôi khi c�ng có th�t�n t�i trên môi trư�ng kh�c nghi�t trong m�t kho�ng th�i gian nh�t ��nh nào �ó. Cho nên �� xác ��nh ch�c ch�n nh�ng cây này có mang gen ngo�i lai hay không, chúng tôi s�d�ng phương pháp PCR ��phân tích.
• Ki�m tra s�có m�t c�a promoter 35S trong cây cúc ���c bi�n n�p
Hình 6.6: ChNi bi>n nQp HCT1 trên môi tr [ng ch\n l\c (sau 4 tu-n)
Hình 6.7: Ch\n l\c cây hoa cúc chuy&n gen cryIA(c) (Bên trái: MAu=Bi ch ng; Bên phYi : MAu chuy&n gen)
Hình 6.8: ChNi bi>n nQp trong môi tr [ng ra rW
Hình 6.9: K>t quY =i n di sYn ph*m c9a phYn ng PCR c9a giBng HCT 1 vZi mNi c9a =oQn promotor 35S. (1) Maker 1kb ladder; (2) Plasmid ART27; (23) XBi ch ng âm; (24) H2O; (5- 22) MAu thí nghi m cây chuy&n gen; (25) Marker
�o�n CAMV 35S là promoter �i�u khi�n s�ho�t��ng c�a gen cryIA(c), anti-ACO và gen nptII. �� xác ��nh s�có m�t c�a �o�n promotor này, chúng tôi ti�n hành làm ph�n�ng PCR v�i c�p m�i 35S1/35S2 ��nh�n m�t trình t� ��c trưng c�a nó. N�u m�u DNA c�a cây nào cho ph�n�ng dương tính (có b�ng) thì ch�ng t� �o�n promoter 35S �ã�ư�c chuy�n thành công vào cây hoa cúc.
Hình 6.10: K>t quY =i n di sYn ph*m PCR c9a mAu HCV1. (1) Maker 1 kb, (2) Plasmit ART27; (3) H2O; (4): XBi ch ng; (5, 6, 8) Cây chuy&n gen; (7) Cây không = ;c chuy&n gen
Sau khi th�c hi�n ph�n �ng PCR, �i�n di s�n ph�m trên gel Agarose và so sánh v�i marker 1 kb, chúng tôi xác ��nh �ư�c các b�ng dài rõ nét kho�ng 195 bp ��i v�i 14 m�u DNA c�a cây cúc
�ã bi�n n�p. Các m�u ��i ch�ng ��u không lên b�ng (hình 6.9).
Còn v�i gi�ng HCV1 (hình 6.10) nh�n th�y các m�u 5, 6, 8 là m�u chuy�n gen khi so sánh v�i marker và các m�u��i ch�ng.
* Ki�m tra s� có m�t c�a gen trong cây cúc bi�n n�p b�ng lai Southern
S� có m�t c�a các gen �ã �ư�c bi�n n�p m�t l�n n�a �ư�c kh�ng ��nh nh�k�t qu�lai DNA. Nh�ng m�u DNA tách ra t�các cây tr�ng bi�n n�p �ư�c x� lý b�ng enzym gi�i h�n sau �ó �ư�c ch�y trên gen và �ư�c c� ��nh lên màng lai nilon và �ư�c lai v�i các m�u dò là các gen anti-ACO, gen cryIA(c) �ư�c tách ra t� vi khu�n và�ư�c�ánh d�u m�u dò v�i các ch�t phát quang hoá h�c.
S� b�t c�p gi�a m�u dò và m�u nghiên c�u s� cho k�t qu� trên phim và qua �ó ta k�t lu�n �ư�c s�có m�t c�a các m�u �ã �ư�c chuy�n gen hay không.
1kb 0,83kb
M 1 2 3 4 5 6 7 NC PC
Hình 6.11: K>t quY lai DNA xác =cnh gen anti-ACO trong cây hoa cúc chuy&n gen; (NC) negative control; (PC) positive control; (M) Marker; (1, 2, 7) MAu ki&m tra
M 1 2 3 4 5 6 7 NC PC
3,145Kb
4kb
Hình 6.12: K>t quY lai DNA xác =cnh gen cryIA(c) trong cây hoa cúc chuy&n gen; (M) Marker; (1, 2, ... 7) MAu ki&m tra; (NC) negative control;
(PC) positive control
Hình 6.13: Các dòng cúc chuy&n gen trNng trong nhà l Zi
* Tr�ng và �ánh giá các dòng cúc chuy�n gen trong �i�u ki�n nhà l��i
Nh�ng dòng cúc chuy�n gen �ang �ư�c lưu gi� và ti�p t�c �ư�c nghiên c�u,�ánh giá trong �i�u ki�n nhà lư�i v�nh�ng tính tr�ng nghiên c�u.
K4t lu.n và h 5ng nghiên c7u t5i i) K�t lu�n
01. �ã hoàn thi�n �ư�c qui trình tái sinh cây t� m�u lá và bư�c ��u chuy�n gen anti-ACO và gen Bt cryIA(c) vào hai gi�ng hoa cúc HCV1 và HCT1.
02. Xác ��nh có m�t gen ngo�i lai anti-ACO và gen Bt trong các cây hoa cúc chuy�n gen b�ng PCR và lai phân t�
DNA Southern blot.
03. �ã thu �ư�c 14 cây hoa cúc mang gen anti-ACO và 20 cây hoa cúc mang gen Bt.
ii) K�ho�ch nghiên c�u trong nh�ng n�m t�i
01. �ánh giá kh� n�ng tươi lâu các cây hoa cúc chuy�n gen anti - ACO trong �i�u ki�n hoa c�t.
02. Th� kh� n�ng kháng sâu xanh và sâu xám h�i ��i v�i nh�ng cây hoa cúc chuy�n gen Bt.
03. Phân tích protein các cây hoa cúc chuy�n gen.
04. �ánh giá m�c �� an toàn c�a cây hoa chuy�n gen v�i sinh thái và môi trư�ng.
Chương 7