ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN
2.6. Phương pháp phân tích thực vật mang gen biến nạp
Điều quan trọng sau khi chuyển gen là cần theo dõi gen chuyển vào cây sẽ được tế bào, đặc biệt là bộ genom của tế bào chủ tiếp nhận như thế nào. Hiện nay có nhiều nhóm phương pháp cần được tiến hành trong quá trình tạo cây trồng chuyển gen. Các nhóm phương pháp đó bao gồm:
(1.) Phân tích tính kháng thuốc (2.) Phân tích hóa tế bào
(3.) Phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử (4.) Phân tích hoạt động của gen chuyển (transgen)
Mỗi nhóm phương pháp hoạt động trên những nguyên lý khác nhau được trình bày dưới đây, các bước kỹ thuật của phương pháp sẽ được trình bày chi tiết ở chương 3.
2.6.1. Phương pháp phân tích tính kháng thuốc
Thực chất phân tích tính kháng thuốc là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng khuốc thông qua hoạt động của gen chuyển.
Thuốc được hiểu ở đây là thuốc kháng sinh như kanamycin khi dùng gen nptII hoặc hygromycin khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar. Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ trạng thái tế bào đến mô sẹo, chồi tái sinh, cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt. Cách thức tiến hành đơn giản: chỉ bổ sung thuốc theo nồng độ nhất định vào môi trường nuôi cấy rồi quan sát ảnh hưởng của thuốc lên mô
hoặc cây. Thông thường là mô và cây mất khả năng tạo lục lạp rồi sau đó chết nâu đen.
Phương pháp thử tính kháng thuốc còn được pháp triển thành phương pháp tạo vết tẩy trên lá. Thuốc kháng sinh được pha ở nồng độ cao (2-5 lần so với thử invitro), bổ sung thêm Twin để tăng khả năng bám dính. Sau đó dùng bút lông quét lên mặt lá xanh của cây cần thử. Cũng có thể nhúng sợi chỉ bằng bông thấm dịch thuốc rồi vắt sợi chỉ qua nhiều lá của nhiều cây. Sau 3-5 ngày có thể quan sát thấy nơi bôi thuốc hay nơi sợi chỉ vắt qua hình thành các vết trắng hoặc nâu trên mặt lá do bị mất diệp lục. Ở những cây có tính kháng các vết đó không hình thành. Để bảo đảm độ chính xác cần tiến hành thử lại những cá thể được chọn 2-3 lần nhắc lại.
Hình 2.8: Hiện tượng gây khối u crown gall do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (a) và gây búi rễ do vi khuẩn A. rhizogens (b) mà bản chất là các gen liên quan đến sinh tổng hợp phytohormon IAA được chuyển nạp từ vi khuẩn sang tế bào thực vật (c)
Hình 2.9: Cấu trúc phân tử X-Gluc dùng làm cơ cho phương pháp nhuộm gus đối với mô thực vật chuyển gen. Khi X-Gluc bị gus khử tạo ra sản phẩm sơ cấp không màu, nhưng sau đó sản phẩm này bị ôxy hóa và dimer hóa thành sản phẩm cuối cùng có màu xanh indogo đặc trưng
2.6.2. Phương pháp phân tích hóa tế bào
Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự có mặt của sản phẩm gus thông qua hoạt động biểu hiện của gen gus. Nhuộm gus được thực hiện trong thí nghiệm xác định biểu hiện tạm thời, mô sẹo, chồi mầm và rễ mới tái sinh. Nhuộm gus cũng được thực hiện để khẳng định gen chuyển được di truyền sang thế hệ sau khi nhuộm phôi của hạt hình thành từ cây chuyển gen.
Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan và không màu. Nhưng ngay sau đó sản phẩm này bị ôxy hóa và dimer hóa thành một phức hệ không tan có màu xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm gia tăng quá trình hình thành sản phẩm màu cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc khuyếch tán sản phẩm sơ cấp đến những vùng không có mặt của gus.
2.6.3. Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Sau bước chọn lọc trên môi trường có chứa các tác nhân chọn lọc như kháng sinh, thuốc trừ cỏ, vấn đề cốt yếu còn lại là phải phân tích được số phận của gen biến nạp trong tế bào nhận bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như sau:
(1.) PCR
(2.) Lai Southern
(3.) Phân tích biển hiện gen
Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới dạng một thể plasmid độc lập tự nhân; (3) Ổn định như một đoạn DNA của một genom trong tế bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp.
Đương nhiên trạng thái thứ ba được ưa chuộng nhất vì tính bền vững của thể biến nạp, nhưng nó hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình tái tổ hợp. Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thuộc nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiện tượng nhân không tương hợp đối với đoạn gen lạ khi hòa đồng vào DNA nhân. Bởi vì vị trí đoạn gen lạ được ghép nối ảnh hưởng đến biểu hiện của chính nó hay gen chủ gần đó cho nên người ta đang quan tâm nhiều đến tái tổ hợp tương hợp hoặc là ghép nối định hướng (Yoder & Kmiec,
1991). Nếu kỹ thuật này thành công thì khả năng thay thế gen trở thành hiện thực và sẽ có giá trị lớn về mặt thực tiễn và lý luận.
i) Phương pháp phân tích cây chuyển gen bằng PCR
Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện với các phòng thí nghiệm chuyên về công nghệ gen thực vật. Gen chuyển là gen đã được biết vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR. Nếu sản phẩm PCR có kích thước đúng như dự kiến thì mẫu phân tích được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (i) Vi khuẩn Agrobacterium mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng. Nếu là mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính, tức là qua thế hệ T1, T2 v.v. dưới dạng hạt rồi thì hoàn toàn loại trừ khả năng này; (ii) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính; (iii) Gen chuyển không hoạt động, tức là không được biểu hiện thành protein có chức năng sinh học. Vì thế kết quả phân tích bằng PCR mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu. (Hầu hết các tạp chí chuyên ngành không chấp nhận những công bố chuyển gen khi tác giả mới đạt đến kết quả phân tích PCR).
ii) Lai Southern
Lai Southern là việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển trong genom của cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với mẫu DNA dò. Mẫu dò chính là một đoạn của gen chuyển có kích thước từ 100-300 bp được đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang. Chi tiết các bước kỹ thuật lai Southern nêu kỹ trong chương 3. Có thể tóm tắt các bước như sau (Hình 2.10):
i. Tách chiết DNA tổng số của mẫu cần phân tích ii. Xử lý cắt hạn chế với 1-2 enzym
iii. Điện di DNA trên gel agarose
iv. Thấm truyền bản gel lên màng nitrosocellulose (còn gọi là blotting)
v. Tổng hợp DNA mẫu dò có đánh dấu bằng phóng xạ hay huỳnh quang bằng PCR với mồi ngẫu nhiên (6-mer oligo).
vi. Lai mẫu dò với màng mang DNA vii. Hiển thị trên phim X quang viii. Phân tích kết quả
Lai Southern góp phần tiến xa hơn một bước trong việc đánh giá kết quả chuyển gen: Một mặt kết quả dương tính khi lai khẳng định gen chuyển tồn tại trong genom cây nhận, đồng thời số lượng băng vạch dương tính cho biết số lượng copy của bản gen chuyển có mặt trong genom cây nhận. Trong nhiều trường hợp lượng copy đó không phải chỉ là 1 bản, mà là 2 hay nhiều bản.
Hình 2.10: Nguyên lý lai Southern để khẳng định sự có mặt của gen chuyển trong genom cây nhận: Sau khi xử lý cắt hạn chế DNA mẫu phân tích được điện di và thấm truyền lên màng và lai với mẫu dò đánh dấu và hiện thị lên phim. Gen chuyển hiển lên thành băng vạch kích thước khác nhau tùy thuộc vị trí cắt hạn chế, từ đó có thể kết luận về số bản copy của gen chuyển trong genom cây nhận
iii) Phân tích biển hiện gen
Khái niệm biểu hiện gen được hiểu trong sinh học phân tử là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Quá trình biểu hiện gen trải qua hai bước: (1) Bước phiên mã từ DNA cho ra mRNA. Muốn đánh giá sự có mặt của sản phẩm phiên mã người ta tiến hành kỹ thuật lai Northern. (2) Bước dịch mã từ mRNA thông qua bộ máy ribosom phân tử polypeptid được tổng hợp với trình tự amino axít chính xác do trình tự nucleotide trong đoạn DNA mã hóa của gen quyết định. Muốn đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra phải tiến hành kỹ thuật lai Western.
Kỹ thuật lai Northern về nguyên lý cũng dựa trên tính cặp đôi base bổ sung của hai sợi axít nucleic, trong trường hợp mẫu là mRNA có trong RNA tổng số tách từ mẫu cần phân tích. Sau khi điện di và thấm truyền RNA tổng số lên màng nitrosocellulose, màng được lai với mẫu dò là các oligonucleotide đánh dấu, được tổng hợp bằng PCR từ gen cần tìm với mồi ngẫu nhiên dài 6 nucleotide. Trong những trường hợp dương tính trên màng nitrosocellulose xuất hiện những băng sản phẩm lai. Gen được phiên mã càng mạnh thì tín hiệu lai càng mạnh.
Kỹ thuật lai Western dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó. Trước hết protein toàn phần được chiết tách từ mẫu cần phân tích, sau điện di trên gel polyacrylamid (PAGE) protein được thấm truyền lên màng nitrosocellulose rồi lai với kháng thể (kháng thể được sản xuất nhờ kháng nguyên gốc tinh sạch hay kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng hay đa dòng).
Quá trình hiển thị sản phẩm lai có thể thực hiện thông qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm hay hiện phim thông qua phản ứng dạ quang ECL.
2.6.4. Phương pháp phân tích chức năng sinh học của gen chuyển Chỉ làm sau khi đã khẳng định nguyên liệu tạo được là cây chuyển gen thực sự thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử ở mức độ phòng thí nghiệm. Xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây chuyển gen được tiến hành bằng kỹ thuật PCR, với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển và DNA của dòng cây cần kiểm tra. Xác định gen chuyển được gắn vào genom cây tái sinh hay không phải thực hiện phép lai phân tử Southern mà mẫu dò là đoạn gen chuyển được đánh dấu huỳnh quang còn DNA nhân cao phân tử được tách từ mô của cây chuyển gen. Xác định gen chuyển có được phiên mã thành mRNA hay không, tức là có được bộ máy sinh tổng hợp protein chấp nhận hay không được thực hiện bằng kỹ thuật lai Northern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh dấu huỳnh quang và RNA toàn phần của mô cây chuyển gen. Bước cuối cùng là xác định gen chuyển có biểu hiện và tạo ra sản phẩm cuối cùng của nó là protein bằng kỹ thuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen và kháng thể đặc hiệu với protein đó được tinh sạch từ
nguồn khác. Mặt khác, hoạt tính gen chuyển còn được thử bằng các phép thử chỉ thị như thử tính kháng kháng sinh, thử tính diệt sâu nhưng ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô nhà lưới.
Điểm tiếp theo là phải xác định phương thức và đặc điểm di truyền của gen chuyển và tính trạng được gen chuyển mã hóa đồng thời kiểm tra mức độ đồng hợp tử của thế hệ con cái chúng bằng cách lai chéo hay tự phối.
Biến nạp gen với mục đích cuối cùng là đưa được tính trạng mong muốn vào cây trồng. Vì thế, khâu phân tích trực tiếp tính trạng đó là khâu có giá trị quyết định cuối cùng. Gen chuyển thuộc các nhóm khác nhau vì thế phương pháp phân tích cũng khác nhau, phụ thuộc vào tính trạng đang được quan tâm và có thể nhóm các phương pháp thành các nhóm như sau:
i) Phân tích tính kháng bệnh
Tính kháng virus, kháng vi khuẩn hay kháng nấm được thử bằng cách lây nhiễm nhân tạo tại các phòng thí nghiệm về bệnh học thực vật với các chủng virus, vi khuẩn hoặc nấm cập nhật.
Sau khâu khẳng định tính kháng bệnh trong phòng thí nghiệm cần thực hiện bước tiếp theo là kiểm tra tính kháng trên đồng ruộng có lây nhiễm nhân tạo. Bước cuối cùng là khảo nghiệm trên đồng ruộng ở nhiều địa điểm và phải qua ít nhất 2 vụ liên tục.
ii) Phân tích tính chống chịu
Tính chống chịu thường được kiểm tra bằng thí nghiệm gây điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhân tạo, tuy nhiên đây là việc làm không dễ. Đối với khô hạn có nhiều cách bố trí thí nghiệm khác nhau: (i) Xử lý hạn bằng cách xử lý PEG hay đường saccharose.
Các chất này cạnh tranh nước với bộ rễ của cây; (ii) Bố trí thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong nhà hoặc buồng trồng cây bằch cách không tưới nước hoặc tưới phục hồi rất hạn chế. Loại thí nghiệm này được tiến hành với cây trồng trên cát sạch, đất trồng cây trong chậu hoặc các khối đất nén; (iii) Tiến hành thí nghiệm trên hiện trường tại những vùng khô hạn. Đất nước Israel là nơi lý tưởng được nhắc đến đối với việc tiến hành các thí nghiệm về hạn vì ở đây có những vùng và thời kỳ hàng nửa năm không có mưa tự nhiên. Tương tự như vậy, khi nghiên cứu về tính chịu mặn, tính chịu phèn v.v. cần có những cách bố trí thí nghiệm tự nhiên minh
và hợp lý, nhưng không được quá khác biệt với điều kiện bất lơi của tự nhiên.
iii) Phân tích gen cải tiến chất lượng sản phẩm
Đây là loại phân tích dễ tiến hành nhất. Khi quan tâm đến tính trạng chất lượng nào và chuyển những gen phù hợp thì sẽ tiến hành các phân tích về chỉ tiêu chất lượng đó, ví dụ tăng hàm lượng β- caroten thì phân tích trực tiếp hàm lượng chất này bằng khối phổ.
Tăng chất lượng tinh bột, tăng độ dẻo của hạt gạo thì xác định hàm lượng amylose, khi giảm được hàm lượng amylose xuống dưới 18% là đạt yêu cầu. Những tính trạng liên quan đến chất lượng bảo quản, chất lượng chế biến cần phải được đánh giá theo cách thức riêng phù hợp với từng loại sản phẩm.
iv) Đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen
Cây chuyển gen sau bước đánh giá ở mức độ phòng thí nghiệm cần phải kiểm tra mức độ an toàn trên đồng ruộng, mức độ an toàn đối với sức khoẻ vật nuôi, con người và khả năng ảnh hưởng lên môi trường. Qui định chung khi khảo nghiệm trồng cây chuyển gen trên đồng ruộng cần phải thu được các thông tin cơ bản sau:
(1.) Gen được chuyển có nguồn gốc từ đâu? Gen được chuyển vào cây trồng thông qua vector nào? Gen được chuyển kèm những gen gì?
(2.) Gen chuyển hoạt động trong điều kiện nào? Sản phẩm tạo ra là gì?
(3.) Gen được chuyển và gen chuyển kèm có thể bị phát tán (chuyển sang cây khác) của hệ sinh thái trong khu vực thông qua hạt phấn của cây chuyển gen hay không? Nếu có thì nguy cơ gì có thể xảy ra?
(4.) Sản phẩm của gen chuyển có gây những thay đổi cơ bản về chất đối với sản phẩm nông nghiệp so với sản phẩm đó được sản xuất ra bằng giống cây bình thường hay không?
(5.) Chất (protein) do gen chuyển tạo ra có gây dị ứng cho người và vật nuôi sử dụng chúng hay không? Cần tiến hành kiểm tra độc hại theo qui định hiện hành của ngành y tế về an toàn thực phẩm.
Phương pháp thử nghiệm trên đồng ruộng và đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen cần được tiến hành bảo đảm các nội dung sau:
(1.) Trồng cách ly và phân tích di truyền mức độ phát tán phấn hoa nếu có đối với cây trồng 1 năm.
(2.) Đánh giá hoạt tính gen chuyển bằng phép thử sinh học về tính kháng sâu, kháng bệnh.
(3.) Thử độc tính và tính gây dị ứng của protein gen chuyển theo qui định của Bộ Y tế.