TẠO CÂY HÔNG CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU
5.2. Hệ thống tái sinh cây hông
a) Nguyên liệu: Sử dụng giống cây hông (Paulownia fortunei).
Cây trong ống nghiệm được dùng làm nguyên liệu cho việc xây dựng hệ thống tái sinh cây hông.
b) Phương pháp
i) Tái sinh từ mảnh lá: Để tái sinh chồi từ mảnh lá, các cây con trong ống nghiệm cao khoảng 5-6 cm với 3-5 cặp lá được sử dụng.
Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1-2 cm2 đặt trong môi trường tái sinh. Theo dõi và đánh giá khả năng tái sinh chồi sau 5 tuần.
ii) Tái sinh từ cuống: Các cuống lá được cắt với chiều dài khoảng 5- 10 mm đặt trong môi trường tái sinh. Theo dõi và đánh giá khả năng tái sinh chồi sau 5 tuần.
iii) Tái sinh từ thân cây: Các đoạn thân cây với chiều dài khoảng 3-5 mm được đặt trong môi trường tái sinh. Theo dõi và đánh giá khả năng tái sinh chồi sau 5 tuần.
iv)Môi trường và điều kiện nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy MS (3) chứa 30 g/l đường, 9 g/l agar với sự hiện diện của các chất kích thích sinh trưởng theo tổ hợp là BA (1, 5,10 mg/l) và NAA (0,1-
0,5-1 mg/l). Mỗi bình tam giác chứa khoảng 6-8 mẫu và mỗi nghiệm thức trung bình khoảng 30 mẫu. Các mẫu được đặt trong điều kiện 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 27- 28oC. Sau 3 tuần cấy truyền một lần.
v) Tái sinh từ phương pháp cắt lớp mỏng tế bào: Lớp mỏng tế bào được cắt ở những vị trí khác nhau của cây, gồm lát cắt ngang (dày khoảng 0,5-2 mm) và lát cắt dọc (dày khoảng 0,5-2 mm, dài khoảng 2-5 mm).
- Vị trí cắt mẫu: cuống lá, phiến lá, gân lá, đốt thân.
- Dùng dao cắt qua các vị trí khác nhau của cây với lát cắt ngang và dọc, dao lam được vô trùng với Hypochlorit calci và rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng.
- Dùng đĩa petri nhựa vô trùng, cấy mẫu vào petri 60 mm, petri được dán kín bằng một lớp parafilm.
- Mẫu in vitro dùng để thí nghiệm được nhân giống bằng cách cắt đoạn có đỉnh sinh trưởng hoặc chồi nách, các mẫu này được cấy trong bình tam giác 250 ml, đậy bằng giấy trong điều kiện chiếu sáng 10 giờ/ngày. Sau 30 ngày cấy, mẫu được dùng để thực hiện lát cắt mỏng. Mỗi đĩa petri được đặt 7 mẫu và các mẫu cắt không có đỉnh sinh trưởng. Đối với đốt cuống lá được cắt ở vị trí giữa chồi nách và lá.
5.2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh cây hông
a) Tái sinh chồi từ mảnh lá: Các mẫu lá với kích thước khoảng 2 cm2 được đặt trong môi trường tái sinh với các chất sinh trưởng và kết quả tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy (bảng 5.1).
Từ bảng 5.1, cho thấy với nồng độ BA thấp (1 mg/l) các mảnh lá gần như không thể tái sinh được chồi con, khi nồng độ BA cao hơn (5 mg/l) thì khả năng tái sinh cao hơn khoảng 60%
khi kết hợp với NAA thấp (0,1 mg/l) và tỉ lệ mẫu lá tái sinh cao nhất (90%) khi nồng độ BA cao (10 mg/l) và nồng độ NAA thấp (0,1 mg/l). Kết quả cho thấy, mảnh lá có khả năng tái sinh cao trong môi trường có các chất kích thích sinh trưởng với nồng độ thích hợp, điều này sẽ tạo thuận lợi cho quá trình chuyển gen sau này.
Bảng 5.1: Kết quả tái sinh chồi từ mảnh lá sau 5 tuần nuôi cấy BA (mg/l) NAA
(mg/l)
Số lượng mảnh lá tạo
chồi
Phần trăm mảnh lá tạo
chồi
Mức độ hình thành
mô sẹo 1 0,1 0/30 0 ++
1 0,5 0/21 0 ++++
1 1 1/27 4 +++
5 0,1 17/29 60 +++
5 0,5 7/29 24 ++++
5 1 10/30 30 +++
10 0,1 27/30 90 +++
10 0,5 18/28 64 +++
10 1 22/29 76 ++++
c) Tái sinh chồi từ cuống lá: Chúng tôi chỉ sử dụng các mẫu cuống lá với kích thước khoảng 5-10 mm được đặt trên môi trường tái sinh với các chất sinh trưởng và kết quả tái sinh như sau:
Bảng 5.2: Kết quả tái sinh chồi từ cuống lá sau 5 tuần nuôi cấy
BA (mg/l) NAA (mg/l)
Số lượng cuống tạo chồi
Phần trăm cuống tạo chồi
Mức độ hình thành mô sẹo 1 0,1 0/30 0 ++
1 0,5 0/35 0 +++
1 1 0/29 0 ++++
5 0,1 14/24 60 +++
5 0,5 2/28 7 ++++
5 1 2/30 6 ++++
10 0,1 23/28 82 +++
10 0,5 29/36 80 +++
10 1 8/30 26 ++++
Kết quả ở bảng 5.2 cho thấy với nồng độ BA thấp (1 mg/l) các cuống lá chỉ hình thành mô sẹo mà không tái sinh được chồi con.
Nồng độ BA cao hơn (5 mg/l) sẽ cho tỉ lệ tái sinh cao hơn (60%) và khả năng tái sinh cao nhất khi nồng độ BA cao (10 mg/l) và nồng độ NAA thấp (0,1- 0,5 mg/l). Lượng NAA càng cao càng tăng hình thành mô sẹo đồng thời ức chế sự hình thành chồi từ cuống lá. Ở tất cả các nghiệm thức mô cuống đều hình thành mô sẹo và các chồi con đều tái sinh thông qua mô sẹo.
d) Tái sinh chồi từ thân cây: Các mẫu thân với kích thước khoảng 2- 5 mm được đặt trên môi trường tái sinh với các chất sinh trưởng và kết quả tái sinh như ở Bảng 5.3.
Bảng 5.3: Kết quả tái sinh chồi từ thân cây sau 5 tuần nuôi cấy
BA (mg/l)
NAA ( mg/l )
Số lượng tạo chồi từ thân
cây
% thân cây
tạo chồi Mức độ hình thành mô sẹo
1 0,1 28/32 80 +++
1 0,5 28/36 55 ++++
1 1 7/27 30 ++++
5 0,1 30/36 83 +++
5 0,5 33/39 84 +++
5 1 12/27 44 ++++
10 0,1 28/30 94 ++++
10 0,5 20/30 66 +++
10 1 16/31 52 +++
Khác với các mẫu lá và cuống, trong thí nghiệm này ở tất cả các nghiệm thức nuôi cấy thân đều tái sinh chồi con cho thấy mô thân cây Hông là mô tế bào có khả năng tái sinh cao ngay cả khi nồng độ BA thấp (1 mg/l) và khả năng tái sinh thấp khi lượng NAA càng cao. Môi trường thích hợp nhất cho sự tái sinh từ thân cây là môi trường MS với 10 mg/l BA và 0,1mg/l NAA và được khuyến cáo sử dụng trong quá trình chọn lọc tạo cây chuyển gen.
e) Kết quả tái sinh từ phương pháp cắt lớp mỏng tế bào: Các lát cắt ngang chồi hoặc rễ được tái sinh từ lớp biểu bì và dưới biểu bì rồi phát triển vào trung tâm. Ở lát cắt dọc, việc phát sinh hình thái chỉ xảy ra ở một đầu của mẫu cắt (ở đốt thân: đầu hướng xuống gốc; ở đốt cuống lá: đầu hướng về phía chồi nách). Các vị trí cắt trên cây là đốt thân (không sử dụng đốt thân thứ 4 trở xuống gốc), đốt cuống lá, mảnh lá. Lát cắt ngang và lát cắt dọc qua các vị trí trên, được đặt vào các môi trường có chất sinh trưởng là BA, NAA, IBA sau 10 và 14 ngày cho các số liệu sau: ở môi trường MS có BA 2 mg/l mẫu cấy sau 10 ngày đã hình thành 100% chồi và mô sẹo xanh đậm.
5.2.3. Đánh giá khả năng tái sinh cây hông bằng chất chọn lọc PPT a) Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT (phosphinothricin) đến mẫu lá và cây hông in vitro và cây tại vườn ươm
Để khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến mẫu lá, cuống, thân và cây Paulownia nhằm tìm những nồng độ chất chọn lọc thích hợp, chúng tôi tiến hành thử nghiệm đặt các mẫu của cây đối chứng không chuyển gen vào môi trường thích hợp cho việc tái sinh cùng với chất chọn lọc với các nồng độ 2,4,6,8 mg/l PPT b) Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến mẫu lá, cuống, thân
Mẫu lá ở nồng độ 2 mg/l: khoảng 30% vẫn còn màu xanh nhưng không hình thành mô sẹo cũng như dấu hiệu của sự tái sinh chồi. Từ nồng độ 4 mg/l trở lên toàn bộ mẫu đều có màu vàng và hoàn toàn không phát triển, do đó chúng ta có thể sử dụng nồng độ 4 mg/l cho việc chọn lọc tái sinh tạo cây chuyển gen.
Mẫu cuống và thân từ nồng độ 2 mg/l trở lên: toàn bộ mẫu đều vàng và hoàn toàn không phát triển, do đó chúng ta có thể sử dụng nồng độ 2 mg/l cho việc chọn lọc tái sinh tạo cây chuyển gen.
c) Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến cây đối chứng
Các cây đối chứng không chuyển gen được đặt vào môi trường MS với chất chọn lọc ở các nồng độ 2, 4, 6, 8 mg/l PPT. Sau thời gian nuôi cấy trên môi trường chọn lọc cho thấy nồng độ 4 mg/l đủ gây chết cây.