TẠO CÂY HÔNG CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU
5.3. Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào cây hông
a) Nguyên liệu
i) Chủng vi khuẩn và plasmid: Sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 chứa plasmid ITB mang gen cryIA(c) (gen kháng sâu), gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ Basta) và gen gusA (gen chỉ thị).
ii) Gen kháng PPT (bar): Gen kháng PPT có nguồn gốc từ loài nấm Steptomyces hygroscopicus. Gen này mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase (PAT), giúp biến đổi PPT từ
dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết cây trồng sang dạng bị acetyl hóa không còn gây độc cho cây.
iii) Gen cryIA(c): Gen cryIA(c) mã hóa cho một loại độc tố delta- endotoxin có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Loại protein này theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể côn trùng làm sâu ngừng ăn và chết.
Môi trường giữ giống là LB có kháng sinh Kanamycin 50 mg/l.
Để nhân giống phục vụ nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn được nuôi cấy lắc qua đêm trong môi trường AB (Chilton et al.,1974).
iv) Thực vật: Sử dụng giống cây hông (Paulownia fortunei). Lá cây trong bình nuôi cấy kích thước khoảng 1-2 cm2 được dùng làm nguyên liệu chuyển gen.
b) Phương pháp chuyển gen
Sử dụng vi khuẩn đã nuôi lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 10 mg/l BA) có bổ sung chất acetosyringone nồng độ 100 àM. Sau đú rửa và diệt vi khuẩn A.
tumefaciens bằng dung dịch kháng sinh Cefotaxim 500 mg/l trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa chất chọn lọc là Phosphinothricin (PPT) và Cefotaxim 500 mg/l. Cấy truyền 2 tuần/lần trên cùng loại môi trường. Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh được cấy truyền sang môi trường ra rễ có chứa PPT. Một số cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm.
5.3.2. Kết quả chuyển gen ở cây hông
a) Ảnh hưởng của PPT đến mảnh lá và khả năng tái sinh chồi
Trước khi tiến hành chuyển gen, chúng tôi khảo nghiệm ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đối với các mảnh lá đối chứng bằng cách đặt chúng vào môi trường tái sinh với các nồng độ 0, 2, 4, 6 và 8 mg/l PPT. Theo dõi sau 4 tuần chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 0 mg/l PPT các mảnh lá đã tạo mô sẹo và bắt đầu tái sinh tạo các chồi con, ở nồng độ 2 mg/l còn một số mảnh lá còn duy trì được màu xanh nhưng không tạo được mô sẹo cũng như tái sinh.
Riêng từ nồng độ 4 mg/l PPT trở lên các mẫu lá đều bị vàng 100%
và không còn khả năng phát triển, do đó chúng tôi sử dụng nồng độ 4 mg/l PPT để chọn lọc mẫu lá sau khi xử lý với vi khuẩn A.
tumefaciens.
Mẫu lá sau khi xử lý với vi khuẩn A. tumefaciens được đặt trên môi trường có PPT nồng độ 4 mg/l , đa số các mảnh lá bắt đầu vàng sau 2 tuần nuôi cấy, một số mảnh lá vẫn duy trì màu xanh nhưng không hình thành mô sẹo, chỉ một số ít khoảng 10% hình thành mô sẹo và một số trong đó bắt đầu tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy. Sau giai đoạn chọn lọc này, các chồi con được chuyển sang môi trường MS để ra rễ với 4 mg/l PPT. Chỉ có vài dòng cây tiếp tục phát triển và ra rễ, được chúng tôi giả định là cây chuyển gen.
Kết quả quá trình chuyển gen được thể hiện như bảng 5.4.
Để khẳng định đây là những cây hông chuyển gen, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT với các nồng độ 0, 2, 4, 6mg/l đến cây hông đối chứng. Chỉ sau 2 tuần, toàn bộ các cây đối chứng từ nồng độ 2mg/l PPT trở lên đều bị vàng lá và chết nhanh chóng. Do đó, chúng tôi cấy cây hông giả định chuyển gen và cây đối chứng vào môi trường ra rễ với chất chọn lọc PPT nồng độ 4 mg/l để thử khả năng chống chịu, sau 2 tuần toàn bộ cây đối chứng chết, trong khi các cây giả định chuyển gen vẫn tiếp tục phát triển và ra rễ, giúp khẳng định đây là những cây hông đã được chuyển gen.
Bảng 5.4: Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trường có 4 mg/l PPT sau khi nhiễm với A. tumefaciens và mẫu lá đối chứng
Thí nghiệm Số mẫu lá
Số mẫu lá tạo mô
sẹo
Số mẫu lá tái sinh
chồi
Số lượng dòng cây chuyển
gen
Tần số chuyển gen (%)
Chuyển gen 580 52 21 5 0,8
Đối chứng 30 0 0 0 0
b) Kết quả phân tích cây hông chuyển gen
i) Kiểm tra cây chuyển gen thông qua gen gus: Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá và chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37oC, mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ không chuyển màu.
Các chồi nhỏ và mảnh lá của cây chuyển gen đã được xử lý với dung dịch X-Gluc, kết quả cho thấy chồi và mảnh lá này có màu xanh chàm đặc trưng khẳng định sự biểu hiện của gen gusA trong cây chuyển gen.
ii) Sự biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen: Trên môi trường có chứa PPT những tế bào và mầm chồi không mang gen bar hoặc gen bar không biểu hiện sẽ bị ngộ độc và chết, chỉ có những cây nhận gen chuyển mới có khả năng sống sót và sinh trưởng với màu xanh bình thường (hình 5.2. và 5.3.).
iii) Kiểm tra qua tính kháng basta ở vườn ươm: Các cây chuyển gen và đối chứng được phun thuốc trừ cỏ Basta tại vườn ươm để kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen.
Gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏ đã được khẳng định trong cây in vitro, tuy nhiên chúng tôi muốn tiếp tục khảo sát sự duy trì và khả năng biểu hiện ổn định của gen này trên cây sau khi được trồng ra môi trường tự nhiên ngoài vườn ươm. Trước hết phải khảo sát ngưỡng gây chết 100% đối với cây đối chứng tại vườn ươm. Cây hông đối chứng trồng tại vườn ươm khoảng 1 tháng tuổi được phun thuốc trừ cỏ Basta với các nồng độ là 100, 150, 200 và 300 mg/l PPT, sau 2 tuần các cây được phun ở nồng độ 200 và 300mg/l PPT hoàn toàn chết còn các cây ở nồng độ 100 và 150 mg/l PPT chỉ ở đỉnh cây bị vàng nâu và sau 4 tuần thì các cây này hồi phục tạo chồi từ các nhánh dưới. Do đó, chúng tôi sử dụng nồng độ 200 và 300 mg/l PPT để phun lên các cây chuyển gen 1 tháng tuổi tại vườn ươm. Sau 2 tuần nhận thấy các cây hông chuyển gen tiếp tục sinh trưởng và phát triển bình thường, chỉ có một dòng cây hơi bị vàng lá phía dưới nhưng vẫn sống và phát triển cho phép chúng tôi khẳng định một lần nữa đây là những cây hông đã nhận được gen chuyển.
v) Kiểm tra bằng PCR đối với gen cryIA(c): Sự hiện diện của gen cryIA(c) được kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt với trình tự DNA của mồi như sau:
mồi 1: ACAGAAGACCCTTCAATATC và mồi 2: GTTACCGAGTGAAGATGTAA.
Kích thước đoạn DNA của gen cryIA(c) ở cây chuyển gen và đối chứng dương tính được khuyếch đại là 0,65 kb. Qui trình tách DNA thực vật được tiến hành theo phương pháp của Dellaporta (1983).
Hình 5.1: Biểu hiện của gen gus trong lá cây hông chuyển gen
Hình 5.2: Cây Hông tái sinh trên môi trường có PPT
Hình 5.3: Cây hông chuyển gen phát triển, cây đối chứng chết trong môi trường chọn lọc PPT
Hình 5.4: Kết quả PCR của gen cryIA(c). (L) Thang chuẩn DNA 1 kb;
(PC) Đối chứng dương tính; (NC) Đối chứng âm tính: cây không chuyển gen; (1-5) các mẫu cây chuyển gen
Sự hiện diện của gen cryIA(c) bằng kỹ thuật PCR và khả năng kháng sâu của cây chuyển gen:
Kết quả phân tích PCR với cặp mồi chuyên biệt đối với gen cryIA(c) cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tính, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng.
Qua đó, chúng tôi khẳng định sự hiện diện của gen cryIA(c) trong nhiễm sắc thể của cây hông chuyển gen.
vi) Kiểm tra tính kháng sâu ở vườn ươm: Các cây chuyển gen và đối chứng được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c) qua khả năng kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá nhỏ của cây trồng tại vườn ươm.
Các cây hông chuyển gen được chuyển ra trồng trong vườn ươm. Để thử nghiệm tính kháng sâu, các lá nhỏ được đặt trong đĩa petri cùng sâu xanh Heliothis armigera. Sau 3 ngày, với các lá đối chứng, diện tích lá bị hại lớn, kích thước sâu tăng rõ rệt, trong khi đó ở lá cây chuyển gen diện tích lá bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng trưởng rất kém và sau 3 ngày sâu hoàn toàn không còn ăn và chết nhiều vào ngày thứ 5 hoặc 6.
vii) Kiểm tra qua lai phân tử Southern và lai miễn dịch Western: Các cây chuyển gen và đối chứng được kiểm tra bằng kỹ thuật
Southern và Western blot để khẳng định sự hiện diện và biểu hiện của gen cryIA(c).
Hình 5.5: Kết quả thử tính kháng sâu của các dòng hông chuyển gen so với đối chứng không chuyển gen
Hình 5.6: Kết quả phân tích Southern blot của cây hông
Hình 5.7: Kết quả Western blot
của của cây hông Hình 5.8: Cây hông chuyển
gen
- Sự hiện diện của gen cryIA(c) bằng kỹ thuật Southern Blot Nhiễm sắc thể của cây hông chuyển gen và đối chứng được tách chiết dựa vào phương pháp sử dụng CTAB. Sau đó DNA của nhiễm sắc thể được cắt bởi enzym giới hạn là Hind III và sử dụng bộ Kit AlkPhos Direct Labelling and Detection Systems của Công ty Amersham Pharmacia Biotech để tiến hành kỹ thuật Southern blot. Thang chuẩn là Lamda DNA cắt bởi Hind III. Đoạn DNA 3,1 kb gồm promoter, gen cryIA(c) và đoạn kết thúc được sử dụng làm đối chứng dương tính. Kết quả phân tích Southern blot (hình 5.6) với các vệt (band) đã khẳng định sự hiện diện và đồng nhất gen cryIA(c) trong cây hông chuyển gen.
- Sự biểu hiện của gen cryIA(c) bằng kỹ thuật Western Blot Sản phẩm protein cryIA(c) trong các cây hông chuyển gen được kiểm tra bằng phản ứng miễn dịch dùng kháng thể gen cryIA. Trên màng nitrocellulose xuất hiện vạch đối với tất cả cây chuyển gen, trong khi đó tại vị trí này (khoảng 65 kDa) không có phản ứng tương tác giữa kháng thể với protein của cây đối chứng. Chứng tỏ gen cryIA(c) hoạt động tốt, hình thành được độc tố Bt trong cây chuyển gen phù hợp với kết quả thử sâu trên cây hông chuyển gen tại vườn ươm.
Kết luận về chuyển gen cây hông
01. Hệ thống nuôi cấy mô và tái sinh cây, chọn lọc tính kháng thuốc trừ cỏ đã được hoàn thiện cho việc chuyển gen vào cây hông.
02. Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid ITB để chuyển gen đã thu được một số dòng cây hông chuyển gen mang gen cryIA(c).
03. Bằng các kỹ thuật sinh học và sinh học phân tử đã xác định được các gen này hiện diện trong cây hông chuyển gen và các gen chuyển đã hoạt động và biểu hiện tính trạng rất rõ rệt. Các dòng cây hông chuyển gen có tính kháng sâu xanh Heliothis armigera rõ rệt.
04. Các cây hông chuyển gen đang được trồng trong khu vườn có giám sát để theo dõi.