3.3.1. Nguyên liệu thí nghiệm
(i) Lá đu đủ bị nhiễm virus PRSV đã được thu thập từ 12 vùng trồng đu đủ tập trung khác nhau ở đồng bằng sông Hồng, ven biển miền trung, đồng bằng sông Cửu Long là: Hà Nội, Hưng Yên, Hải Phòng, Nam Hà, Ninh Bình, Lạng Sơn, Nghệ An, Nha Trang, Tp.
Hồ Chí Minh, Long An, Tiền Giang, Bình Định. Lá được rửa sạch bằng H2O và ethanol sau đó giữ ở -80oC để sử dụng cho tách RNA tổng số; (ii) Vector pCAMBIA2300 do tổ chức CAMBIA, Australia cung cấp; (iii) p2K7 plasmid do Dr. James Dale, Trường Đại học Queensland, Australia cung cấp; (iv) Vector pCR2.1, pSETA do hãng Invitrogen cung cấp; (v) Các hóa chất, enzym sử dụng của các hãng Sigma, Biolab, Invitrogen v.v..
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
a) Tách RNA tổng số chứa mRNA mã hóa protein vỏ của virus PRSV (i) Hoá chất: Đệm tách RNA: Tris- HCl 200 mM; EDTA 100 mM;
SDS 1%; Met 2% (v/v), pH 9.0; Na - acetate 3 M, pH 4.5; LiCl 8 M; Đệm TE: 10 mM Tris - HCl; 1 mM EDTA pH 8.0. Tất cả các dung dịch được pha bằng nước cất hai lần khử ion đã được xử lý với DEPC 0.1% (diethyl pyrocacbonate) và được khử trùng.
(ii) Dụng cụ: Cối chày sứ, đầu côn, ống ly tâm 50 ml, eppendorf v.v. sạch được ngâm trong nước có 0.1% DEPC ở 37oC trong 2h sau đó khử trùng đối với đầu côn, eppendorf, ống ly tâm 50 ml, với cối chày sứ sấy ở 180oC trong 4h.
(iii) Qui trình
- Sử dụng cối chày sứ đã làm lạnh trước (ở 0oC đến -80oC) để nghiền 2 g lá bị nhiễm PRSV trong nitơ lỏng cho đến khi lá nhuyễn thành dịch đồng nhất;
- Thêm vào 10 ml đệm tách lắc đều. Sau đó thêm vào 1V phenol: Chloroform: isoamy alcohol (tỉ lệ 25:24:1), tiếp tục lắc đều;
- Ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, thu dịch trong chuyển sang ống sạch;
- Thêm vào 1/10V NaOAc 3 M và 2,5V ethanol 100%, lắc nhẹ và giữ ở –20oC trong 4 giờ;
- Ly tâm thu tủa RNA ở 14.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC;
- Rửa tủa RNA bằng ethanol 80%. Ly tâm 14000vp, 3 phút;
- Làm khô tủa và tan trong 40o (l nước DEPC 0,1%);
- Thêm vào 1V LiCl 8 M giữ ở –20oC qua đêm;
- Ly tâm thu tủa RNA ở 14.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC;
- Rửa tủa RNA bằng ethanol 80%. Ly tâm 14.000vp, 3 phút;
- Làm khô tủa và tan trong 400 ml nước DEPC 0,1%. Lấy ra 1 ml để kiểm tra chất lượng trên gel agarose bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose.
(iv) Kỹ thuật điện di phân tích DNA bằng gel agarose - Agarose 0,8 - 1%;
- Dung dịch TBE 5X: Tris base 54g/l; axít boric 27,5 g/l;
EDTE 0,5 M 20 ml/l, pH 8,0;
- Ethidium bromide (EtBr) 10 mg/ml;
- Đệm tra mẫu: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glicerol 100% và dẫn nước đến 1 ml;
- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 hoặc 1 g agarose hòa trong
100 ml dung dịch TBE 0,5 X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn (Nếu quá trình đun bị mất nhiều nước thì phải thêm nước cho đủ 100 ml). Để nguội xuống khoảng 50-60oC, đổ dung dịch vào khay gel điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel agarose đã đông cứng gỡ khay gel và đặt vào bể điện di. Đổ TBE 0,5X ngập mặt gel ~2 mm, tháo lược ra khỏi bản gel.
- Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 1V mẫu: 1V đệm 1X và nhỏ vào các giếng tra mẫu trên bản gel.
- Chạy điện di: điện thế từ 60-80V. DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển bằng màu bromophenol blue để biết lúc nào ngừng điện di.
- Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khay và ngâm vào dung dịch EtBr 0,5 mg/l trong thời gian khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửa bản gel bằng nước và soi dưới ánh sáng tử ngoại 300 nm trên máy soi DNA, chụp ảnh bằng phim polaroit.
(v) Phương pháp điện di protein bằng gel acrylamide
- Dung dịch hỗn hợp acrylamide: 30% acrylamide: 0,8%
bisacrylamide.
- Dung dịch đệm gel tách: 1,5 M Tris-HCl; 10% SDS, pH 8,8.
- Dung dịch đệm gel cô: 1M Tris-HCl; 10%SDS, pH6,8.
- 10% ammonium persulfate.
- TEMED.
- Đệm tra mẫu: 50 mM Tris-HCL pH 6,8; 100 mM dithiothreitol; 2%SDS; 1% Bromophenol blue; 10% glycerol.
- Đệm điện di: 25 mM Tris-HCl; 250 mM glycine; 0,1%
SDS, pH 8,5.
- Dung dịch Coomassie Brilliant Blue: 0,25 g Coomassie Brilliant Blue tan trong hỗn hợp 45ml metanol: 45 ml H2O:
10 ml axít acetic.
- Dung dịch rửa gel: 30% metanol: 10% axit acetic.
- Chuẩn bị gel tách 12% acrylamide: Hóa chất được làm ấm ở nhiệt độ phòng và được trộn theo thứ tự trong bảng 3.1:
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất chuẩn bị gen tách 12% acrylamide
Thành phần Nồng độ gel 12% (10 ml/gel) H2O
Dung dịch acrylamide Dung dịch đệm gel tách Ammonium persulfate TEMED
4,55 ml 3,30 ml 1,25 ml 100 àl 5 àl
Trộn đều và đổ hỗn hợp gel tách vào khuôn tránh tạo bọt khí trong gel, lấp đầy bề mặt bằng nước cất và giữ nguyên vị trí trong 30 phút cho gel đông. Sau khi gel đông, đổ bỏ nước cất trên mặt trên gel, thấm khô bằng giấy thấm và tiếp tục đổ gel cô. Hỗn hợp gel cô được trộn theo thứ tự bảng 3.2.
Đổ hỗn hợp vào khuôn gel bên trên gel tách, đặt răng lược tránh tạo bọt và giữ nguyên vị trí bản gel cho đến khi gel đông (khoảng 30phút). Sau đó tháo lược khỏi bản gel, lắp bản gel vào máy điện di và đổ đầy đệm điện di và tra mẫu. Mẫu được trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 1:1 và được tra vào giếng tra mẫu bằng xylanh.
Bảng 3.2: Thành phần hỗn hợp gen được trộn
Thành phần Nồng độ gel 5% (3ml/gel) H2O
Dung dịch hỗn hợp acrylamide Dung dịch đệm gel cô
Ammonium persulfate TEMED
1,80ml 0,40ml 0,75ml 30àl 3àl
Máy điện di được nối với nguồn điện với hiệu điện thế ~60- 80V, cho đến khi vạch mầu di chuyển gần hết bản gel (khoảng 90 phút). Tháo gel khỏi khuôn và đặt vào dung dịch nhuộm lắc nhẹ trong 4giờ ở nhiệt độ phòng. Lấy gel khỏi dịch nhuộm và lắc rửa trong dung dịch rửa cho đến khi bản gel trở nên trắng. Lấy gel quan sát và chụp ảnh.
b) Nhân bản gen CP bằng phương pháp RT-PCR (i) Thiết kế primer
Để thiết kế primer, 20 trình tự axít amin của các coat protein khác nhau đã được sưu tập từ ngân hàng SWISS-PROT của trang web: www.ncbi.nlm.nih.gov trên mạng internet. Các trình tự này
được so sánh với nhau bằng chương trình Megalign của phần mềm DNAstar. Đoạn trình tự axít amin giống nhau nhất về phía hai đầu của các protein đã được chọn và chuyển thành trình tự các nucleotid để sử dụng làm primer.
(ii) Phương pháp RT-PCR
Hóa chất: MuLV reverse Transcriptase 50U/l, RNase Inhibitor 20U/l, Oligo d(T)16, 50 M (poly T làm đoạn mồi để sao mã ngược), dNTP 10 mM (mỗi loại), Taq DNA polymerase 5U/l, Primer: sử dụng các primer khác nhau với nồng độ gốc 25 pmol, 10 X PCR buffer, MgCl2 25 mM, Dịch RNA tổng số đảm bảo chất lượng. Tất cả các hóa chất được giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Qui trình: Tổng hợp sợi khuôn thứ nhất của đoạn cDNA: hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị theo trình tự như sau:
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng
Thành phần phản ứng Thể tớch (20 àl) Nồng độ cuối Dung dịch MgCl2
Đệm PCR 10X Nước đã xử lý DEPC dNTP
Rnase inhibitor Oligo dT RNA tổng số
MuLV reverse Transcriptase 4 2 2
2 (mỗi loại) 1
1 1 1
5 mM 1 X - 1 mM 1 U/àl 2,5 àM
~1 àg 2,5 U/(àl)
Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt: 42oC trong 2giờ;
95oC trong 5phút và 5oC trong 5 phút. Sản phẩm được sử dụng cho phản ứng tiếp theo là khuếch đại đoạn cDNA. Khuếch đại đoạn cDNA: hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị theo trình tự như sau:
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng khuếch đại đoạn cDNA
Thành phần phản ứng Thể tớch (100àl) Nồng độ cuối Dung dịch MgCl2
Đệm PCR 10 X Nước khử ion Mồi 1
Mồi 2
Taq DNA polymerase Sợi đơn cDNA (mới tổng hợp)
4 8 57.5 5 5 0,5 20
2 mM 1 X -
1,25 pmol 1,25 pmol 2,5 U/100àl
c) Gắn vào vector và nhân dòng
3.3.3. Phân lập gen CP từ PRSV a) Chất lượng RNA tổng số
Dung dịch RNA đã được lấy điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và hàm lượng RNA trên bản điện di cho ta thấy rằng băng vạch RNA tách được rõ ràng và đậm với kích thước tương ứng với các loại RNA khác nhau là 5S, 16S và 28S.
Như vậy, chất lượng RNA là rất tinh sạch không bị phân cắt và có nồng độ cao đáp ứng được cho các thí nghiệm tiếp theo.
b) Tối ưu hóa PCR để nhân gen CP
Phương pháp gradien nồng độ nhiệt độ kết cặp bằng máy Mastercycle gradien đã được sử dụng để xác định nhiệt độ kết cặp tối ưu đối với các primer thiết kế.
Hình 3.24: RNA tổng số có chứa RNA của PRSV tách từ lá đu đủ nhiễm PRSV ở các vùng khác nhau của Việt Nam (gel agarose 1%)
Gradien nhiệt độ kết cặp gồm: 46.6; 50,8; 56,6; 61,8; 65oC. Chu trình nhiệt là 94oC trong 5 phút; {94oC trong 1 phút, gradien nhiệt độ kết cặp trong 1phút, 72oC trong 1 phút } lặp lại 35 vòng; 72oC trong 10 phỳt với DNA khuụn mẫu là 10 àl cDNA sợi đơn từ phản ứng sao mã ngược. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1% cho thấy có 4 cặp primer đã nhân lên được đoạn gen CP vơí kích thước đúng như lý thuyết là khoảng 780 bp đến 850 bp độ nhạy khác nhau nhưng nhạy nhất là cặp primer V (nh2-nh5). Do vậy, chúng tôi đã chọn cặp này với nhiệt độ kết cặp là 55oC cùng
với cặp MB11-MB12 để sàng lọc PRSV từ các mẫu thu ở Việt Nam.
c) Thiết kế mồi
Muốn nhân được đoạn gen CP bằng RT-PCR cần có các cặp mồi đặc hiệu. Để làm việc đó 20 trình tự amino axít của 20 protein CP từ Ngân hàng protein SvISS-PROT được tải về, dùng chương trình MegaAlign đã tìm ra sáu đoạn amino acid bảo thủ cao nằm ở hai đầu của đoạn gen cần nhân. Từ đó thiết kế các loại mồi thuận và ngược chiều như trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: Trình tự các cặp mồi dung để nhân bản đoạn gen CP từ PSRV có nguồn gốc từ Việt Nam
Tên mồi Trình tự Ghi chú
NH1 (Thuận) 5’ ÂẢR ÂAY GẢR GCN GTN GAY 3’
NH2 (Thuận) 5’ GAR AAR YTN AAR GAR AAR AAR 3’
NH3 (Thuận) 5’ GAY GGN AAY GAY WSN CAN WSN 3’
NH4 (Ngược) 5’ RTT NCK CAT NCC NAR NSW RTG 3’
NH5 (Ngược) 5’ YCK YTC NGT RTT YTC YTT RTT 3’
NH6 (Ngược) NCK NSW NGT RTT NCK NAR NGC NGC 3’
R=A /G;
N=G/A/C/U Y=C/U W=A/U S=G/C K=G/T Dấu / nghĩa là hoặc
Hình 3.25: Kết quả nhân đoạn gen CP với gradien nhiệt độ kết cặp và các cặp primer khác nhau. M: Marker 1Kb; I: Gen CP được nhân với NH1&NH4; II: Gen CP được nhân với NH1&NH5; III: Gen CP được nhân với NH1&NH6; IV: Gen CP được nhân với NH2&NH4; V: Gen CP được nhân với NH2&NH5; VI: Gen CP được nhân với NH1&NH6;
VII: Gen CP được nhân với NH3&NH4 ; VIII: Gen CP được nhân với NH3&NH5; IX: Gen CP được nhân với NH3&NH6; Lane 1...5: các nhiệt độ kết cặp khác nhau 46.6; 50.8; 56.6; 61.8; 65oC.
d) Sàng lọc gen CP của PRSV từ các mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV ở Việt Nam
Kết quả sàng lọc (hình 3.27.) bằng phương pháp RT-PCR đã cho thấy rằng chỉ có một đoạn gen CP duy nhất được nhân lên với tất cả các mẫu nhiễm PRSV được sàng lọc. Kết quả này lặp lại khi sử dụng hai cặp primer MB11-MB12 và NH2-NH5. Điều này có thể được khẳng định rằng gen CP của PRSV ở Việt Nam có cùng một kích thước và như vậy có thể chúng là cùng một chủng PRSV.
Hình 3.26: Kết quả khảo sát và sàng lọc nhân bản gen CP bằng các mầu PRSV của Việt Nam. Gen CP được nhân bằng cặp primer MB11- MB12 (trái) và NH2-NH5 (phải). Dòng M: Marker 1Kb; Dòng 1...13: Mẫu nhiễm PRSV của Việt Nam; dòng 14: Mẫu không nhiễm PRSV của Malaysia
e) Phân tích trình tự nucleotide của gen CP
Đoạn gen CP sau khi được nhân lên với hai cặp primer MB11- MB12 và NH2-NH5 được đưa vào vector pCR2.1. Vector tái tổ hợp này được tinh sạch và đọc trình tự. Chúng tôi đã nhận được kết quả trình bày ở hình 3.28 .
Sử dụng chương trình Aligment của phần mềm DNAstar để so sánh trình tự gen CP được nhân lên bằng hai cặp primer khác nhau.
Kết quả so sánh cho thấy hai trình tự này là tương đồng nhau (giống nhau ~98%). Hai trình tự này cũng được so sánh với các trình tự gen CP khác trong ngân hàng gen của trang Web: www.ncbi.nlm.nih.gov trên mạng internet. Kết quả mức độ giống nhau đạt từ 87,6 % đến 96,8%.
Các nucleotide của PRSVN và NH2NH5 tương đồng nhau nhưng do trình tự của PRSVN (907 bp) dài hơn trình tự của NH2NH5 (781 bp) và có điểm cắt của enzym Xba I và Sac I ở hai đầu mút (trong trình tự của primer) thuận tiện hơn cho việc gắn vào các vector nên chúng tôi đã chọn đoạn gen PRSVN cho thí nghiệm tiếp theo.
Ở dòng 1, băng DNA ~900bp đã quan sát được. Đó là băng DNA của gen PRSVN. Trong các dòng 2, 3, 4 các băng DNA khác nhau cũng đã nhận được tương ứng với kích thước ~630 bp, ~715 bp và ~725 bp. Các băng này được cắt từ gen PRSVN theo đúng như trình tự gen qui định. Điều này chứng tỏ trình tự gen nhận được là chính xác.
GTCTAGATGTCCAAAACTGAAGCTGTGGATGCTGGTCTGAATGAAAAGCTAAAAGAAAAG 60 GAAAAACAGAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGATAAACAAAAAGATAAAGATAATGATGGA GCTAGTGACGGAAATGATGTGTCAACTAGCACAAAAACTGGAGAGAGAGATAGAGATGTC 180 AACGCCGGAACTAGTGGAACTTTCACTGTTCCAAGGATAAAGTCTTTTACTGATAAGATG ATTTTACCAAGAATTAAGGGAAAGTCTGTCCTTAATTTAAATCATCTTCTTCAGTATAAT 300 CCGAAACAAATTGACATCTCAAACACTCGTGCCACTCAATCTCAATTTGAAAAGTGGTAT GAGGGAGTGAGGAATGATTATGGTCTTAGTGATAACGAAATGCAAGTGATGTTAAATGGT 420 TTGATGGTTTGGTGTATCGAAAATGGTACATCTCCAGACATATCTGGTGTTTGGGTAATG ATGGATGGGGAAACCCAGGTTGATTATCCTATCAAACCTTTAATTGAACATGCAACTCCT 540 TCATTTAGGCAAATCATGGCTCACTTCAGTAACGCGGCAGAGGCATATATCGCGAAGAGA
AATGCAACTGAGAGGTACATGCCGCGGTATGGAATTAAAAGGAATTTGACTGACATTAGC 660 CTCGCTCGATATGCTTTTGATTTCTATGAGGTGAACTCGAAAACACCTGATGGGGCTCGT GAAGCTCATATGCAGATGAAGGCTGCAGCGCTACGTAATACTAGTCGCAGAATGTTCGGA 780 ATGGACGGCAGTGTCAGTAACAAGGAAGAAAACACGGAGAGACACACAGTGGAAGATGTC AATAGAGACATGCACTCTCTCCTGGGTATGCGCAATTAAATACTCGCACTTGTGTGTTTG 900 GAGCTCC 907 V.MSKTEAVDAGLNEKLKEKEKQKEKEKEKDKQKDKDNDGASDGNDVSTSTKTGERDRDV 60 NAGTSGTFTVPRIKSFTDKMILPRIKGKSVLNLNHLLQYNPKQIDISNTRATQSQFEKWY 120 EGVRNDYGLSDNEMQVMLNGLMVWCIENGTSPDISGVWVMMDGETQVDYPIKPLIEHATP 180 SFRQIMAHFSNAAEAYIAKRNATERYMPRYGIKRNLTDISLARYAFDFYEVNSKTPDGAR 240 EAHMQMKAAALRNTSRRMFGMDGSVSNKEENTERHTVEDVNRDMHSLLGMRN.ILALVCL 300 EL
302
Hình 3.28: Trình tự nucleotide của gen PRSVN (gen CP) được nhân bằng cặp primer MB11-MB12 (hình trên)
GAGAAGCTGAAGGAGAAGGAGAAGCAGAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGATAAACAAAAA 60 GATAAAGATAATGATGGAGCTAGTGACGGAAATGATGTGTCAACTAGCACAAAAACTGGA
GAGAGAGATAGAGATGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTTTCACTGTTCCAAGGATAAAG 120 TCTTTTACTGATAAGATGATTTTACCAAGAATTAAGGGAAAGTCTGTCCTTAATTTAAAT
CATCTTCTTCAGTATAATCCGAAACAAATTGACATCTCAAACACTCGTGCCACTCAATCT 300 CAATTTGAAAAGTGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTATGGTCTTAGTGATAACGAAATG
CAAGTGATGTTAAATGGTTTGATGGTTTGGTGTATCGAAAATGGTACATCTCCAGACATA 420 TCTGGTGTTTGGGTAATGATGGATGGGGAAACCCAGGTTGATTATCCTATCAAACCTTTA
ATTGAACATGCAACTCCTTCATTTAGGCAAATCATGGCTCACTTCAGTAACGCGGCAGAG 540 GCATATATCGCGAAGAGAAATGCAACTGAGAGGTACATGCCGCGGTATGGAATTAAAAGG AATTTGACTGACATTAGCCTCGCTCGATATGCTTTTGATTTCTATGAGGTGAACTCGAAA 660 ACACCTGATAGGGCTCGTGAAGCTCATATGCAGATGAAGCTGCAGCGCTACGTAATACTA
GTCGCAGAATGTTCGGAATGGACCGCAGTGTCAGTAACCAGGGAAGAAAACACCGAAAGA 780 A 781 EKLKEKEKQKEKEKEKDKQKDKDNDGASDGNDVSTSTKTGERDRDVNAGTSGTFTVPRIK 60 SFTDKMILPRIKGKSVLNLNHLLQYNPKQIDISNTRATQSQFEKWYEGVRNDYGLSDNEM 120 QVMLNGLMVWCIENGTSPDISGVWVMMDGETQVDYPIKPLIEHATPSFRQIMAHFSNAAE 180 AYIAKRNATERYMPRYGIKRNLTDISLARYAFDFYEVNSKTPDRAREAHMQMKLQRYVIL 240 VAECSEWTAVSVTREENTER 260
Hình 3.29: Trình tự amino acid dịch mã từ gen nhân bằn cặp mồi NH2+NH5
3.3.4. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CP của PRSV
Trước tiên gen PRSVN được tách bằng cắt với hai enzym XbaI và SacI, rồi được đưa vào vector p2K7 bằng T4 ligase để tạo ra cấu trúc với 35S promoter và Nos terminator. Vector tái tổ hợp này được biến nạp vào E.coli TOP 10F' và được chọn lọc bằng khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường LB đặc có 50mg/l kanamycin. Các khuẩn lạc tiếp tục được sàng lọc bằng PCR và tách plasmid để cắt với enzym giới hạn (hình 3.30).
Dòng 1, chúng tôi đã nhận băng DNA ~900 bp và ~6 kb. Băng 900 bp là gen PRSV và 6 kb là phần của vector p2K7. Trong các dòng 3, 4, 5 các băng DNA cũng đã nhận được tương ứng ~630bp,
~725 và ~590 là các băng được cắt ra từ gen PRSVN. Dòng 6 có băng DNA ~2,8 kb là gen PRSVN gắn với 35S promoter và Nos terminater. Kết quả này cho thấy gen PRSV đã được gắn 35S promoter và Nos terminator trong p2K7 vector.
Cấu trúc 35S pro - gen PRSV - Nos ter (băng 2,8 kb) đã được tinh sạch và được đưa tiếp vào vector chuyển gen pCAMBIA đã mở bằng enzym Hind III và KpnI. Vector tái tổ hợp này được biến nạp vào Agrobacterium và được chọn lọc bằng khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường LB đặc có 50mg/l kanamycin. Các khuẩn lạc tiếp tục được sàng lọc bằng PCR và tách plasmid để cắt với enzym giới hạn (hình 3.30).
Dòng 1, chúng tôi đã nhận được băng DNA ~900 bp, ~9,6 kb và băng ~800 bp. Băng DNA 900bp là gen PRSV còn lại hai băng 9,6 kb và 800 bp được cắt ra từ vector pCAMBIA2300, 35S pro và Nos ter. Ở dòng 2 có băng ~590 bp là được cắt từ gen PRSVN. Ở dòng 3 nhận được băng 2,8 kb là cấu trúc 35S pro-gen PRSVN-Nos ter. Như vậy, vector chuyển gen đã được tạo ra với một cấu trúc đúng (hình 3.31).
Hình 3.31. Phân tích enzym giới hạn để kiểm tra cấu trúc vector p2K7 có chứa gen PRSV. Dòng M: Marker 1Kb; Dòng 1: p2k7-PRSV được cắt với Xba I & Sac I;
Dòng 2: p2k7-PRSV được cắt với Xba I &
Ban II; Dòng 3: p2k7-PRSV được cắt với Dra I & Sac I; Dòng 4: p2k7-PRSVN được cắt với Xba I & Nde I; Dòng 5: p2k7- PRSVN được cắt với Xba I & Nru I; Dòng 6: p2k7-PRSV được cắt với Hind III & Kpn I; Dòng 7: p2k7-PRSV không cắt
Hình 3.32. kết quả cắt với enzym giới hạn để kiểm tra cấu trúc vector pCAMBIA2300 có chứa gen PRSVN. Dòng M: Marker 1Kb; Dòng 1: p2300-PRSV được cắt với Xba I & Sac I;
Dòng 2: p2300-PRSV được cắt với Xba I & Nru I; Dòng 3: p2300-PRSV được cắt với Hind III & Kpn I
3.3.5. Biểu hiện gen CP của PRSVN trong E.coli
Gen PRSVN đã được đưa vào vector pRSETA và được biến nạp vào chủng E.coli kết quả được kiểm tra băng cắt với enzym giới hạn (hình 3.33).
Hình 3.33: Kết quả cắt với enzyme giới hạn để kiểm tra cấu trúc vector pRSETA có chứa gen PRSV. DòngM: Marker 1Kb; Dòng 1: pRSETA- PRSV được cắt với Xho I & Nco I; Dòng 2: pRSETA-PRSV được cắt với Nde I; Dòng 3: pRSETA-PRSV được cắt với Hind III & Dra I; Dòng 4: pRSETA-PRSV không cắt; A: Clone 1; B: Clone 6
Hình 3.34: Sự biểu hiện gen PRSV trong E.coli bằng điện di protein tổng số trên gel acrylamide 12% (trái) và Western blotting (phải). Dòng M: Protein marker 200; 118; 78; 47.1; 31.4; 25.5; 13.8; 8.3 kD; Dòng 1:
Protein tổng số đối chứng âm tách từ chủng E.coli BL21(DE3) (mẫu 1);
Dòng 2: Protein tổng số chứa đựng protein PRSV của PRSV của Việt Nam tách từ chủng E. coli BL21(DE3). Dòng 3: Protein tổng số đối chứng âm tách từ chủng E.coli BL21(DE3) (mẫu 2) Dòng 4: Protein tổng số chứa đựng protein CP của PRSV của Malaysia tách từ chủng E. coli BL21(DE3)
Dòng 1, chúng tôi nhận được băng DNA ~1,1 Kb, ~2,9 Kb.
Băng 1,1Kb là gen PRSVN có kèm với Nos ter, còn băng 2,9 kb là phần của vector pRSETA. Ở dòng 3 và 4 có băng DNA tương ứng
~ 690 bp và 590 bp được cắt ra từ gen PRSVN. Kết quả cắt với enzym đúng như trình tự gen qui định. Như vậy cấu trúc pRSETA- PRSVN nhận được là chính xác. Plasmid pRSETA-PRSVN được biến nạp lại vào chủng E.coli BL21(DE3) để biểu hiện gen PRSVN.
Sau khi protein tổng số được cố định trên màng, lai với kháng thể và phát hiện bằng nhuộm BCIP/NBT, băng protein ~40kD đã xuất hiện trên dòng 2 mà không thấy xuất hiện trên dòng 1 và 3 là mẫu đối chứng âm. Băng protein này tương ứng với băng protein CP của PRSV của Malaysia ở dòng 4. Điều này cho thấy rằng protein qui định bởi gen PRSVN của PRSV của Việt Nam đã được biểu hiện. Như vậy, gen PRSVN đã được đưa vào pCAMBIA2300 có khả năng dịch mã sang protein bình thường