3.2.1.Căn cứ khoa học và thực tiễn của việc tìm kiếm gen kháng bệnh đạo ôn
Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, một số bệnh do virut, vi khuẩn và nấm đã gây nên những thiệt hại vô cùng to lớn và đang làm giảm đi chất lượng sản phẩm cũng như năng suất cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng. Đối với cây lúa thì một trong những bệnh có sức tàn phá mạnh nhất là bệnh đạo ôn. Bệnh này do nấm Pyricuria orizae gây ra. Theo ước tính của FAO, thiệt hại do bệnh này đã làm giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7-17,5%. Những nơi bị bệnh nặng có thể bị giảm tới 80%.
Vì vậy, vấn đề cần đặt ra là tạo ra được nhiều giống lúa kháng bệnh, giúp hạn chế dụng các loại thuốc hóa học trừ sâu gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người, gia súc và môi trường sinh thái đồng thời giảm được tối thiểu sự thất thoát mùa vụ. Tuy nhiên, kinh nghiệm trước đây cho thấy rằng những giống lúa kháng thường bị mất tính kháng sau một vài vụ trồng. Do vậy, cần phải tạo ra được những giống lúa có sức kháng bền hơn. Muốn vậy thì gen đa kháng phải được kết hợp từ nhiều cá thể khác nhau.
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học mà chủ công là các kỹ thuật chỉ thị phân tử cùng với các quan điểm lựa chọn chúng có thể cung cấp những giải pháp mới trong việc phát hiện, chọn lọc và duy trì nhiều kiểu gen kháng bền hơn ở lúa. Kết quả là một số lượng lớn gen kháng đạo ôn đã được lập bản đồ dựa trên các chỉ thị phân tử như: Pi1(t), Pi2(t), Pi4(t), Pi5(t), Pi6(t), Pi9(t), Pi10(t) và Pi11(t) (Causse và CS., 1994), Pi5(t) và Pi7(t) (Wang và CS, 1994) Pia, Pib, Pik, Pit, Pita, Pi12(t), Pi17(t), Pi18(t), Pi19(t), Pi20(t), Pi23(t), Pi62(t) và Pi157(t) (Nagato và Yoshomura, 1998), Pitq1, Pitq5, Pitq6 và Pilm2 (Tabien và CS, 2000), Pi21(t) (Fukuoka và CS, 2001).
Các kết qủa tách dòng, đọc trình tự nucleotide của gen kháng bệnh đạo ôn Pi-2(t) ở giống lúa C101A51 và so sánh với trình tự của các tác giả đã được công bố trong Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc tế. Pi-2(t) là một trong những gen kháng đã được lập bản đồ, liên kết chặt với dấu phân tử RG64, nằm trên nhiễm sắc thể số 6 và cách đoạn RG64 một khoảng 2,8 cM. Gen này cho tính kháng ở cả hai giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa.
3.2.2. Phân lập gen Pi-2(t)
a) Nhân gen kháng đạo ôn Pi-2(t) bằng kỹ thuật PCR
Mẫu DNA tổng số của giống lúa C101A51 sau khi tách chiết được pha loãng và xác định mức độ hấp thụ tử ngoại (OD) trên máy đo quang phổ đã đảm bảo đủ độ tinh khiết và nồng độ cần thiết được dùng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi RG64F/RG64R.
Cặp mồi này được thiết kế dựa trên hai đầu của đoạn gen kháng đạo ôn Pi-2(t) đã công bố trong Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc tế. Theo lý thuyết, sử dụng cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gen có kích thước 1,2 kb. Sản phẩm PCR hoàn thành được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1%.
Kết quả điện di với giống lúa C101A51, chúng tôi thu được sản phẩm PCR rất đặc hiệu, kích thước phân tử của đoạn được nhân lên khoảng 1,2 kb (hình 3.20.). Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết cũng như phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài khi họ sử dụng cặp mồi này để nghiên cứu giống lúa C101A51. Điều này chứng tỏ genom của giống C101A51 đã nghiên cứu có mang gen kháng đạo ôn Pi-2(t).
b) Tách dòng gen kháng đạo ôn Pi-2(t)
Sau khi gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCR→2.1, chúng tôi tiến hành biến nạp vào tế bào E.coli DH5α. Cấy trải trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin, IPTG, X-gal. Trong môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì các khuẩn lạc E.coli mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang vector pCR→2.1 gốc (không đính thêm DNA ngoại lai) sẽ có màu xanh.
Để kiểm tra kết quả lai sản phẩm PCR vào vectơ pCR2.1 và biến nạp vào tế bào E.coli DH5α, chúng tôi nhặt ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng và xanh để tách chiết. Kết quả tách chiết DNA plasmid được tiến hành điện di trên gel agaroza 1%. Kết quả được trình bày ở hình 3.21.
1 2 3
1,2kb
Hình 3.20: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RG64. (1) Marker; (2-3) Sản phẩm PCR giống lúa C101A51.
Hình 3.21: Kết quả điện di các plasmid tái tổ hợp mang gen kháng đạo ôn Pi- 2(t). (1-2) Plasmid tách từ khuẩn lạc xanh; (3-16) Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng.
Trên ảnh điện di ta thấy các plasmid ở các kênh 3-16 có khả năng là các plasmid tái tổ hợp vì chúng có kích thước lớn hơn vectơ pCR2.1 gốc và chúng tôi chọn các mẫu mang các plasmid có kích thước lớn này để tiếp tục nghiên cứu. Mặc dù vậy, trong quá trình gắn sản phẩm PCR vào vector, có thể có một số sản phẩm phụ cũng được gắn vào vector. Tức là, có những đoạn có kích
thước lớn hơn hoặc nhỏ hơn đoạn gen kháng đạo ôn Pi-2(t) chúng tôi thấy cần nhân lên. Do đó, cần phải kiểm tra sản phẩm plasmid đã chọn bằng phương pháp cắt enzym giới hạn. Dựa vào bản đồ vector pCR2.1 có một điểm cắt của EcoRI nằm trong vùng cắt gắn đa vị trí. Do đó, chúng tôi sử dụng enzym EcoRI để cắt plasmid tái tổ hợp thành vector và đoạn DNA ngoại lai riêng rẽ. Chúng tôi đã tiến hành cắt mẫu mang khuẩn lạc có màu trắng (mang đoạn DNA ngoại lai) và mẫu mang khuẩn lạc có màu xanh với enzym EcoRI.
Sau khi cắt, sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1%. Kết quả điện di được trình bày ở hình 3.22.
1 2 3 4 5 6
1,2kb 1,2kb
Hình 3.22: Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym giới hạn EcoRI. (1) Marker; (2) Sản phẩm PCR trước khi gắn vào vector;
(3) Plasmid tách từ khuẩn lạc xanh; (4) Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng; (5) Plasmid tách từ khuẩn lạc xanh cắt bằng EcoRI; (6) Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng cắt bằng EcoRI.
Qua ảnh điện di ta thấy, ở kênh số 5 sau khi cắt bằng enzym EcoRI cho ra một băng có trọng lượng phân tử đúng bằng trọng lượng phân tử của vector pCR2.1 còn kênh số 6 cho ra hai băng:
một băng có kích thước tương ứng với kích thước của vector pCR2.1; một băng có kích thước 1,2 kb đúng bằng với kích thước của băng sản phẩm PCR. Kết quả này cho phép ta khẳng định sản phẩm PCR đã được gắn vào vector pCR2.1.
c) Xác định trình tự nucleotide sản phẩm PCR
Những plasmid mang gen Pi-2(t) của giống lúa C101A51 đã được tách với số lượng lớn để xác định trình tự nucleotid và so sánh với trình tự gen kháng đạo ôn Pi-2(t) đã công bố trong Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc tế bằng chương trình phần mềm CLUSTAL W1.81.
Kết quả phân tích cho thấy trình tự nucleotid của sản phẩm mà chúng tôi thu được sau phản ứng PCR so với trình tự mà các tác giả đã công bố trong Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc tế có độ tương đồng cao (99,35%). Kết quả nhận được sẽ góp phần vào việc thiết kế vector mang gen Pi-2(t) phục vụ chuyển gen và phát triển lúa kháng đạo ôn trong tương lai.
d) Kết luận về phân lập gen Pi-2(t)
01. Bằng kỹ thuật PCR, sử dụng cặp mồi RG64F/RG64R, chúng tôi đã nhân được gen kháng đạo ôn Pi-2(t) có kích thước 1,2 kb từ DNA hệ gen của giống lúa C101A51.
02. Đã tách dòng phân tử gen kháng đạo ôn Pi-2(t) từ giống lúa C101A51 trong vector tách dòng pCR2.1.
03. Đã xác định trình tự nucleotide của gen kháng đạo ôn Pi- 2(t) và so sánh với trình tự mà các tác giả đã công bố trong Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc tế. Kết quả có độ tương đồng cao 99,35%.
3.2.3. Phân lập gen Pi-1(t) kháng đạo ôn
Tương tự như phương pháp phân lập gen Pi-2t trên và dựa vào dấu phân tử RZ536 liên kết chặt với gen kháng đạo ôn Pi-1, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi RZ536F/RZ536R để nhân đoạn gen kháng đạo ôn Pi-1 có kích thước 234 bp. Sau đó, đoạn gen này được tách dòng bằng vector tách dòng pCR2.1.TOPO và sau đó được phân tích trên máy xác định trình tự DNA tự động (3100 - Avant Genetic Analyser) với bộ kit của hãng Applied.
Kết quả đọc trình tự gen Pi-1 và so sánh với các trình tự đã công bố cho thấy có độ tương đồng cao (99,15%) được thể hiện ở hình 3.23.
Hình 3.23: Trình tự gen kháng đạo ôn Pi -1 từ giống lúa Tẻ tép so với trình tự nucleotit trong Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc tế (C101Lac).