TẠO DÒNG LÚA INDICA CHUYỂN GEN
7.2. Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào lúa và tạo dòng lúa biến đổi gen kháng rầy nâu
7.2.1. Nội dung nghiên cứu
Tiêu chuẩn hóa phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium và súng bắn gen trên các giống lúa nhóm indica (IR64, KDML105) đang trồng phổ biến ở đồng bằng Sông Cửu Long và tiến hành chuyển gen hữu dụng GNA để tạo dòng lúa biến đổi gen kháng rầy nâu.
7.2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
a) Vật liệu thực vật: Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium và máy bắn gen đã được thực hiện trên các giống lúa nhóm indica (IR64, KDML105) đang trồng phổ biến ở nước ta (ĐBSCL) và giống Taipei 309 thuộc nhóm japonica làm đối chứng.
b) Các phương pháp chuyển gen: Gen được chuyển bằng 2 phương pháp sau:
i) Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium
Tạo mô sẹo: Hạt gạo và phôi non (2 tuần sau trổ) của các giống KDML 105, IR 64 và Taipei 309 được dùng làm vật liệu nuôi cấy.
Chuẩn bị vi khuẩn: Dòng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang plasmid pTOK233 nhận từ Công ty Thuốc lá Nhật Bản (Hei và ctv.
1994) được dùng để chuyển gen.
Vi khuẩn A. tumefaciens, từ ống tồn trữ trong glycerol 50%, được nuôi cấy trên môi trường AB (Chilton và ctv. 1974). Từng khuẩn lạc một của vi khuẩn được chuyển nuôi trong môi trường YEP (An và CS. 1988) có hygromycin 50 mg/l và nuôi 28-30 giờ, ở 28oC. Dung dịch vi khuẩn này được li tâm trong 15 phút (2.800 vòng/phút). Vi khuẩn thu được pha loãng trong 10ml dung dịch PIM2 chứa 100 mM AS và ủ ở 29oC trong 14-16 giờ với tốc độ lắc 200 rpm (đạt mật số OD600: 1,6-1,9), bổ sung 200 mM AS trước khi chủng lên mô sẹo và phôi non.
Khử trùng bề mặt: Các hạt gạo sau khi bóc vỏ và hạt lúa từ bông lúa 2 tuần sau trổ được khử trùng bằng dung dịch Sodium
hypochloride 2% trong 30 phút (2 lần), sau đó rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng.
Nuôi cấy phôi non: Phôi non của hạt lúa được tách dưới kính soi nổi, đặt lên môi trường lây nhiễm vi khuẩn MSGAs với bề mặt của thuẫn hướng lên trên.
Hạt gạo: Các hạt gạo sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo MSCI. Sau 3 tuần, các mô sẹo có khả năng sinh phôi được tách nhỏ khoảng 1-2 mm và chuyển sang môi trường tiền lây nhiễm MSCI và giữ ở 28oC khoảng 4-5 ngày rồi chuyển sang môi trường MSGAs.
Mỗi phôi non và mô sẹo trên môi trường MSGAs được chủng với 10 àl dung dịch vi khuẩn A. tumefaciens, ủ 2 - 3 ngày trong tối ở 24-25oC. Sau 3 ngày, các phôi non và mô sẹo được chuyển sang môi trường MSRe có carbenicillin 250 mg/l và cefotaxim 100 mg/l để ức chế sự phát triển A. tumefaciens.
Chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen: Sau 3 tuần, các mô sẹo phát triển từ phôi non hay từ mô sẹo được chủng với vi khuẩn được tách nhỏ thành 1-2 mm, cấy trên môi trường chọn lọc MSSe có carbenicillin 250 mg/l, cefotaxim 100 mg/l và Hygromycin 30 mg/l trong 3 tuần. Các mô sẹo kháng hygromycin được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có hygromycin 50 mg/l. Các dòng kháng hygromycin được chuyển sang môi trường tăng sinh N6P trong 2 hoặc 3 tuần trước khi chuyển sang môi trường tái sinh MSRe. Các dòng kháng này được giữ trong phòng nuôi cây có cường độ ánh sáng 2.500 lux, độ ẩm 70%, nhiệt độ 28oC, 16 giờ chiếu sáng/ngày.
Cây tái sinh được chuyển sang môi trường tạo rễ MSR. Cây con sau đó được chuyển trồng nhà kính cho các phân tích tiếp theo.
ii) Chuyển gen bằng súng bắn gen
Chuẩn bị mô sẹo: Hạt gạo của các giống lúa KDML105, IR 64, Taipei 309 được dùng cho các thí nghiệm nuôi cấy mô và chuyển gen.
Hạt gạo được khử trùng như bước trên. Hạt gạo được cấy trên môi trường tạo mô sẹo MSCI và nuôi trong tối ở 28oC. Theo dõi sự phát triển của mô sẹo trong 3 tuần. Các mô sẹo có dạng sinh phôi được chọn và tách nhỏ (3 mm) trên môi trường N6 trước khi bắn gen ít nhất 4 giờ.
Quy trình bắn gen: Dòng E.coli mang plasmid pWG1515-gusA- hpt mang gen hpt kháng hygromycin và gen gus, pUbi-cryIA(c), pUbi-GNA được dùng để chuyển vào các giống lúa.
Dòng vi khuẩn chứa các plasmid được bảo quản, tồn trữ trong glycerol 50% (v/v) và nuôi cấy trên môi trường LB. Từng khuẩn lạc đơn của E.coli được nuôi trong môi trường TB chứa Ampicilline 100 mgl-1 và nuôi từ 15-18 giờ ở nhiệt độ 37oC. Dung dịch vi khuẩn này được dùng cho ly trích plasmid-DNA. DNA của plasmid được ly trích theo bộ Kit (Concert Rapid Plamid Purification Systems, hãng Life Technologies) theo phương pháp của Birnboim và Doly (1979). DNA được pha loóng trong TE ở nồng độ 1àg/àl. DNA của dòng pWG1515-gusA-hpt được bắn riêng lẻ hoặc cùng kết hợp với các gen hữu dụng khác. DNA này được dùng cho quy trình bắn gen.
DNA được tẩm trên các hạt vi đạn bằng vàng (Au) có kích thước 1à, cỏc vi đạn mang DNA được bắn vào mụ sẹo đó nuụi 4 giờ trên môi trường N6 nhờ máy bắn gen Biolistic PDS-1000 He với các khoảng cách và áp lực bắn khác nhau.
Chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen: Sau khi bắn 20-24 giờ, các mô sẹo được chuyển sang môi trường phục hồi MSCI để nhân mô sẹo. Sau 2 tuần, các mô sẹo được tách nhỏ 1-2 mm và chuyển sang môi trường chọn lọc MSSe có hygromycin 30mg/l. Sau 3 tuần, các mô sẹo sống sót được tách nhỏ và chuyển sang môi trường chọn lọc lần thứ 2 có hygromycin 50 mg/l.
Các dòng kháng hygromycin và phát triển qua 2 lần chọn lọc được chuyển qua môi trường N6P (nhân nhanh mô sẹo) và theo dõi sự phát triển của mô sẹo từ 2-3 tuần. Các mô sẹo phát triển tốt được chuyển sang môi trường tái sinh MSRe và nuôi ở 28oC trong tối 1 tuần trước khi được chuyển đến phòng sáng có ẩm độ 70%, nhiệt độ 28oC và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Cây tái sinh được chuyển sang môi trường tạo rễ MSR. Sau khi rễ đã phát triển đầy đủ cây con chuyển vào chậu đất và trồng ở nhà kính.
c) Các phương pháp đánh giá cây chuyển gen: Việc đánh giá cây chuyển gen được tiến hành theo hai mức độ chính là ở phòng thí nghiệm và trong nhà kính.
i) Trắc nghiệm sự biểu hiện gen gus
Trắc nghiệm sự biểu hiện tạm thời gen gus trong tế bào được chuyển gen được thực hiện ở các mô sẹo vào ngày thứ 3 sau khi chủng hoặc bắn, trắc nghiệm sự biểu hiện ổn định ở các mô sẹo phát triển tốt qua chọn lọc trước khi tái sinh và ở cây tái sinh.
Các vật liệu gồm mô sẹo được chủng A. tumefaciens hoặc bắn gen sau 3 ngày và đoạn phiến lá dài 5-10 mm của các cây tái sinh được chuyển vào lỗ của đĩa nhiều giếng có chứa dung dịch X-Gluc.
Quan sát sự biểu hiện gen gus, sau 24 giờ ủ ở 37oC các mẫu có những điểm màu xanh. Diệp lục tố trong lá được tẩy bằng hỗn hợp aceton: methanol (1:3).
ii) Thử nghiệm sinh học tính kháng đối với rầy nâu
Vật liệu và dụng cụ: Dụng cụ nuôi rầy (lồng, khay, chậu nhỏ, thuốc trừ nấm v.v.); Dụng cụ chọn lọc rầy (lồng kính, khay nhỏ, pen, thước, thẻ nhỏ v..v); Giống lúa Tài Nguyên mùa làm thức ăn cho rầy (30-45 ngày tuổi); Giống Ptb33 làm giống chuẩn kháng, giống TN1 làm chuẩn nhiễm; Các dòng lúa chuyển gen cần chọn lọc.
Phương pháp: Chọn lọc theo phương pháp hộp mạ của IRRI, có chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện của nước ta. Giống được ngâm ủ nhú mầm, cấy trong khay bùn mịn thành hàng, 5 lần nhắc lại kể cả TN1 và Ptb33. Thả rầy đồng (cùng) tuổi 2 hoặc 3 khi cây mạ 2 hoặc 3 lá (2-4 ngày sau khi cấy) với mật số 4-6 con/tép. Đánh giá khi giống chuẩn nhiễm cháy rụi ở cấp 9 (7-10 ngày sau khi thả rầy), theo thang điểm cấp 9 của IRRI.
7.2.3. Kết quả thực hiện chuyển gen
a) Tiêu chuẩn hóa quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens:
Sự biểu hiện tạm thời của phản ứng gus thể hiện plasmid đã chuyển vào tế bào chủng với A. tumefaciens.
Qua 3 lần thử nghiệm, tỷ lệ mô sẹo có phản ứng gus khác nhau tùy giống, nhìn chung còn thấp, khoảng 6-12,5% trên các giống indica so với giống japonica đối chứng, 22-38% (bảng 7.1).
Qua chọn lọc và tái sinh các dòng kháng phát triển, thu được 7 dòng Taipei 309; 5 dòng KDML105 và 4 dòng IR64.
Trắc nghiệm sự biểu hiện gus trên lá các dòng tái sinh cho thấy, số dòng cho phản ứng gus dương tính ít hơn số dòng tái sinh (bảng 7.2) có thể do các dòng thoát khỏi sự chọn lọc hoặc đoạn DNA được chuyển bị loại trừ khỏi tế bào trong quá trình phân chia, phân hóa.
Hình 7.1: Sự sống sót và phát triển của các mô sẹo trên môi trường chọn lọc (Hyg 50 mg/l) sau 2 tuần nuôi cấy
Hình 7.2: Cây chuyển gen KDML105 tái sinh và sự biểu hiện gen gus
Bảng 7.1: Tỷ lệ có biểu hiện gus ở các giống lúa thí nghiệm Tỉ lệ mô sẹo biểu hiện gus tạm thời (%) STT Tên giống
Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 Taipei 309 24,0 22,7 38,2 2 KDML105 8,0 10,0 12,5 3 IR64 6,0 0 10,0
Bảng 7.2: Số dòng tái sinh từ các mô sẹo qua chọn lọc
STT Tên giống Số dòng tái sinh
Số dòng biểu hiện gus dương tính 1 Taipei 309 7 3
2 KDML105 5 2
3 IR64 4 3
b) Tiêu chuẩn hóa chuyển gen bằng súng bắn gen: Máy bắn gen Biorad được sử dụng. Các áp lực và khoảng cách bắn khác nhau được thử nghiệm để tìm ra các thông số bắn thích hợp. Kết quả cho thấy khi bắn ở khoảng cách A với áp lực 900, 1.100psi cho kết quả tốt hơn khi bắn ở các thông số khác.
Khi bắn ở khoảng cách A với áp lực 1.350psi, tuy cho tỷ lệ phản ứng gus tạm thời cao, nhưng tỷ lệ mô sẹo phát triển qua chọn lọc thấp hơn ở áp lực 900 và 1.100psi, có thể do áp lực cao làm tổn thương các tế bào mô sẹo (bảng 7.3).
Bảng 7.3: Ảnh hưởng thông số bắn trên hiệu quả chuyển gen ở giống Taipei 309
Khoảng
cách Áp lực (psi) Phản ứng gus tạm
thời (%) Tỷ lệ mô sẹo sống sau chọn lọc (%)
900 12 7,3
1100 14 9,7
A (rack1-3)
1350 16 5,2
900 2 0
1100 4 0
B (rack 2-4)
1350 2 0
Sau khi thử nghiệm các thông số bắn thích hợp, các giống lúa đang trồng phổ biến tại đồng bằng sông Cửu Long được thử nghiệm khả năng tương thích với hệ thống chuyển gen.
Tỷ lệ mô sẹo có phản ứng gus tạm thời khác nhau tùy giống, nhưng còn rất thấp ở các giống indica so với giống japonica đối chứng (bảng 7.4).
Bảng 7.4: Tỷ lệ mô sẹo biểu hiện gus của các giống lúa STT Tên giống Phản ứng GUS tạm thời
(%) Tỷ lệ mô sẹo sống sau chọn lọc (%) 1 Taipei 309 14,6 10,8 2 KDML105 9,5 7,7
3 IR64 12 8,5
Bảng 7.5: Số dòng tái sinh từ các giống được chuyển gen
STT Tên giống Số cây tái sinh
1 Taipei 309 5
2 KDML105 3
3 IR64 2
Qua chọn lọc và tái sinh các mô sẹo sống sót, thu được 5 dòng Taipei 309; 3 dòng KDML105; 2 dòng IR64 (bảng 7.5). Các dòng tái sinh này được thử nghiệm sự biểu hiện gus (hình 7.3) và được chuyển sang trồng trên đất trong nhà lưới và phát triển bình thường (hình 7.4 - 7.5).
c) Kết quả chuyển gen kháng sâu GNA vào lúa: Sau khi tiêu chuẩn hóa phương pháp chuyển gen, hai gen hữu dụng GNA (trên plasmit pUbi-GNA) được chuyển vào các giống lúa KDML105, IR64 và Taipei309 (japonica) bằng súng bắn gen. Gen GNA được biết tạo tính kháng rầy nâu, gen cryIA(c) tạo tính kháng sâu đục thân.
Kết quả chuyển nạp gen GNA được tóm tắt ở bảng 7.6. Ở áp lực 1100A, giống KDML105 cho tỷ lệ mô sẹo sống qua chọn lọc lần 2 đạt 8,3% so với giống Taipei309 đạt 12,7%. Giống IR64 có tỷ lệ thấp hơn, 3,9%.
Bảng 7.6: Kết quả chuyển gen plasmid pUbi-GNA Tỉ lệ mô sẹo sống sau
chọn lọc lần 1 (%)
Tỉ lệ mô sẹo sống sau chọn lọc lần
2 (%) Tên giống
900A 1100A 900A 1100A Số dòng
tái sinh
KDML105 16,8 22,6 6,7 8,3 9 IR64 13,2 14,4 6,4 3,9 6 Taipei 309 20,8 21,3 9,6 12,7 12
Hình 7.3: Kết quả thử nghiệm sự biểu hiện tạm thời gen gus
Hình 7.4: Các dòng chuyển gen trồng trong nhà kính
Hình 7.5: Sự sinh trưởng bình thường của cây chuyển gen
Hình 7.6: Thử nghiệm tính kháng rầy nâu
của các dòng lúa chuyển gen GNA Hình 7.7: Hai dòng lúa sống sót khi thử tính kháng rầy
d) Thử nghiệm tính kháng rầy nâu của các dòng nhận gen GNA:
Các dòng biến đổi gen GNA thế hệ T4 được thử nghiệm tính kháng
rầy nâu với giống chuẩn kháng Ptb33 mang gen kháng Bph2 và Bph3, giống chuẩn nhiễm TN1 không mang gen kháng.
Kết quả được trình bày ở bảng 7.6 cho thấy trong các dòng lúa KDML105 chuyển gen GNA, một dòng T29 (14-1-2-5-2) có tính kháng cấp 3, so với giống chuẩn kháng cấp 1, chuẩn nhiễm cấp 9, giống bố mẹ gốc KDML105 cấp 9. Tỷ lệ dòng biến đổi gen cho phản ứng cấp 5 chiếm tỷ lệ 35,4% (17/48 dòng). Giống lúa có cấp kháng rầy nâu 3-5 trong thử nghiệm nhà lưới thường kháng rầy nâu trong điều kiện ngoài đồng. Các giống lúa đang trồng trong sản xuất hiện nay hầu như chưa có giống nào có tính kháng cấp 1.
Bảng 7.7: Kết quả thử rầy đối với các dòng lúa KDML 105 chuyển gen GNA
STT Ký hiệu Dòng Cấp hại Phản ứng
1 T1 12-1- 1-1-1 7 N
2 T2 12-1-1-1-2 7 N
3 T3 12-1-1-2-1 5 HN 4 T4 12-1-1-2-2 5 HN 5 T5 12-1-1-3-1 7 N
6 T6 12-1-1-4 7 N
7 T7 12-1-2-1-1 9 RN 8 T8 12-1-2-1-2 Không thử Không thử 9 T9 12-1-3-1-1 7 N 10 T10 12-1-3-2-1 7 N 11 T11 13-1-1-2-1 7 N 12 T12 13-1-4-1-1 7 N 13 T13 13-1-5-1-1 7 N 14 T14 13-1-6-1-1 7 N 15 T15 13-1-4-2-1 7 N 16 T16 13-1-6-1-2 5 HN
17 T17 13-1-2--1-2 5 HN 18 T18 13-1-2-1-1 7 N 19 T19 13-1-3-1-1 7 N
20 T20 13-1-3-1-2 5 HN
21 T21 14-1-1-1-1 7 N 22 T22 14-1-1-2-1 5 HN
23 T23 14-1-1-6-1 7 N 24 T24 14-1-1-7-1 7 N
25 T25 14-1-1-7-2 5 HN 26 T26 14-1-1-8-1 5 HN 27 T27 14-1-2-3-1 5 HN 28 T28 14-1-2-5-1 5 HN 29 T29 14-1-2-5-2 3 HK 30 T30 14-1-2-6-1 7 N 31 T31 14-1-2-6-1 5 HN
32 T32 14-1-2-6-2 5 HN
33 T33 14-1-3-2-1 7 N
34 T34 14-1-3-2-1 7 N
35 T35 14-1-4-1-1 7 N 36 T36 14-1-4-4-1 5 HN 37 T37 14-1-5-4-1 5 HN 38 T38 14-1-6-4-1 5 HN 39 T39 14-1-7-6-1 7 N 40 T40 14-1-7-6-1 5 HN 41 T41 14-1-7-6-1 Không thử Không thử 42 T42 14-1-7-6-1 7 N 43 T43 14-1-8-2-1 7 N 44 T44 14-1-8-2-2 5 HN 45 T45 14-1-8-3-1 7 N 46 T46 14-1-8-5-1 7 N 47 T47 14-1-8-5-2 7 N 48 T48 14-1-9-2-1 7 N 49 T49 16-1-1-1-1 7 N 50 T50 16-1-1-1-2 7 N 51 TN1 Chuẩn nhiễm rầy 9 RN 52 PTB3 Chuẩn kháng rầy 1 K 53 KDML105 Giống bố mẹ
** T8 và T41 không đủ hạt để thử rầy
e) Kết luận về chuyển gen kháng rầy vào cây lúa: Từ các kết quả trên, cho thấy có thể áp dụng các hệ thống chuyển gen qua trung gian A. tumefaciens hay dùng súng bắn gen đã được tiêu chuẩn hóa
trong điều kiện phòng thí nghiệm của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long để chuyển các gen hữu dụng vào cây lúa.
Các dòng tái sinh được chuyển gen với plasmid pUbi-GNA (mang gen kháng rầy nâu GNA) sinh trưởng bình thường trong nhà kính, biểu hiện sự kháng rầy nâu ở cấp 3-5.