VÀO CÂY BÔNG VẢI
4.2. Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy mô và tái sinh cây bông in vitro phục vụ chuyển gen
Cây bông vải là một đối tượng rất khó thành công trong nuôi ấy in vitro. Trên thế giới có hàng trăm phòng thí nghiệm đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm việc nuôi cấy mô tế bào cây bông, nhưng kết quả chỉ hạn chế trên hai giống là Sisamrong (Thái Lan) và Cooker (Hoa Kỳ) (Trương Thu Thủy et al. 2003). Vì vậy, cần tập trung nghiên cứu hoàn thiện hai kỹ thuật tái sinh là thông qua đa chồi và thông qua phôi soma nhằm tìm ra cách thức thích hợp cho những nguyên liệu làm giống khác nhau.
4.2.1.Tái sinh cây bông bằng phương pháp tạo đa chồi
a) Giống bông: Giống bông 254 được Viện Nghiên cứu Cây Bông, Nha Hố cung cấp.
b) Phương pháp tiến hành tạo đa chồi ở cây bông i) Khử trùng hạt và chuẩn bị nguyên liệu tái sinh cây
Các hạt bông sau khi đã bóc vỏ cứng được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phút, tiếp theo lắc trong dung dịch javen 60% trong 20-25 phút và rửa nhiều lần đến khi nước trong. Cuối cùng hạt được thấm khô bằng giấy lọc vô trùng và tách bỏ lá mầm, thu lấy thân phôi có cả đỉnh rễ và đỉnh chồi.
ii) Cảm ứng mô sẹo, cảm ứng đa chồi và tái sinh cây
Phôi sau đó được đặt lên các môi trường cảm ứng mô sẹo C1- C20. Sau 10 ngày, đỉnh chồi của phôi được cắt với độ dài trung bình 2 mm và cấy lên các môi trường tạo đa chồi S1-S5 một cách ngẫu nhiên như bảng 4.1. Sau 5 tuần, những đỉnh chồi tạo một chồi gọi là có phản ứng, tạo nhiều hơn một chồi được gọi là tạo đa chồi, hay là tạo cụm chồi. Chúng được cấy chuyển lên chính môi trường tạo đa chồi ban đầu và theo dõi sau 3 tuần tiếp theo. Sau đó, các chồi đơn được tách ra từ các cụm chồi và cấy chuyển lên các môi trường kéo dài chồi (E0-E2). Chồi cao khoảng 2-4 cm, thì được kích thích tạo rễ trên các môi trường R1-R2. Cây con cao hơn 3 cm được trồng trên đất để thu được cây tái sinh.
iii) Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Các tổ hợp môi trường nuôi cấy đã nói ở trên được trình bày trong bảng sau đây:
Mô nuôi cấy được đặt trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC và chế độ chiếu sáng 8h/16h với cường độ ánh sáng 2.000lux.
Bảng 4.1: Thành phần các môi trường tái sinh cây và tạo đa chồi Thành phần cơ bản
chung của các môi trường
Các muối MSa cơ bản: 30g/L sacharoza, 9g/L agar, 1g/L than hoạt tính cho môi trường E và R Thành phần chất điều
khiển sinh trưởng trong các môi trường
2,4-Db (mg/L)
Kinc (mg/L)
BAPd (mg/L)
NAAe (mg/L)
C0 - - - -
C1 0,05 - 0,40 0,10 C2 0,10 - 0,40 0,10 C3 0,20 - 0,40 0,10 C4 0,40 - 0,40 0,10 C5 0,05 - 0,80 0,10 C6 0,10 - 0,80 0,10 C7 0,20 - 0,80 0,10 C8 0,40 - 0,80 0,10 C9 0,05 - 1.00 0,10 C10 0,10 - 1.00 0,10 C11 0,20 - 1.00 0,10 C12 0,40 - 1.00 0,10 C13 0,05 - 1,50 0,10 C14 0,10 - 1,50 0,10 C15 0,20 - 1,50 0,10 C16 0,40 - 1,50 0,10 C17 0,05 - 2.00 0,10 C18 0,10 - 2.00 0,10 C19 0,20 - 2.00 0,10 Môi trường
cảm ứng mô sẹo
C20 0,40 - 2.00 0,10 S1 - 0,50 0,50 0,10 S2 - 1.00 1.00 0,10 S3 - 2.00 2.00 0,10 S4 - 2,50 2,50 0,10 Môi trường
tạo đa chồi
S5 - 1.00 2.00 0,10
E0 - - - -
E1 0,10 0,10 - Môi trường
kéo dài chồi
E2 0,50 0,50 -
R1 0,20
Môi trường
tạo rễ R2 0,50
a: Murashige và Skoog; b: 2,4 Dichlorophenoxyacetic axít; c: Kinetin;
d: 6-Benzyl amino purin; e: 1-Naphthyl acetic axít.
c) Kết quả và thảo luận
i) Mô sẹo hóa phôi và phá vỡ ưu thế đơn chồi
Trên môi trường không có chất điều khiển sinh trưởng CO, phôi nhanh chóng vươn dài thành cây con và phát triển lá. Trong khi đó, trên tất cả cảc môi trường cảm ứng mô sẹo còn lại (C1-C20), 100%
phôi không phát triển thành cây hoàn chỉnh mà phình to, phát sinh mô sẹo màu trắng. Như vậy, sự kết hợp 2,4-D, BAP và NAA đã có tác dụng làm kìm hãm quá trình biệt hóa, tạo ra nhiều tế bào liên tục phân chia. Mức độ kìm hãm và mô sẹo hóa mạnh hơn trên các môi trường có hàm lượng 2,4-D cao hơn (những môi trường có 0,2 và 0,4 mg/L). Sau 10 ngày, chiều cao trung bình của phôi là 1,5 cm, dao động từ 1-4 cm. Lúc này, đỉnh chồi được cắt làm nguyên liệu tạo đa chồi. Môi trường C16 có mức độ mô sẹo hóa vừa phải và đồng đều nhất, được coi là môi trường mô sẹo hóa tối ưu.
ii) Sự hình thành cụm chồi
Với mong muốn thu được cụm chồi, các đỉnh chồi của phôi kích thước 2 mm đã được đặt lên các môi trường kích thích tạo đa chồi (S1-S5) là các tổ hợp khác nhau của Kinetin, BAP và NAA.
Sau 5 tuần, chồi mới chỉ xuất hiện ở dạng đơn chồi, hoặc dạng cụm chỉ có 2-3 chồi (bảng 4.2.). Cụm chồi vào thời điểm này có tỉ lệ rất thấp (khoảng 32%) và phát triển rất chậm so với đơn chồi.
Tỉ lệ phôi bị chết hoặc bị ức chế tương đối cao như trong bảng 4.2 có thể do phôi được cấy trên môi trường khá dày đặc, các hợp chất phenol do mẫu vật tiết ra đã ức chế phôi. Cũng có thể hàm lượng các chất điều khiển sinh trưởng như vậy là tương đối lớn, phần nào phá vỡ thế cân bằng giữa sự mô sẹo hóa và biệt hóa thành chồi sau này.
Sau giai đoạn 5 tuần, các đỉnh chồi đã hình thành đơn chồi hoặc cụm chồi, hoặc không có chồi nhưng vẫn chưa phải là mô chết đều được cấy chuyển lên chính môi trường đa chồi ban đầu là S2-S4, với hy vọng tiếp tục thu được cụm chồi. Ba tuần sau khi được nuôi cấy một lần nữa trên các môi trường tạo đa chồi, các cụm chồi trung bình 4 chồi/cụm và nhiều nhất là 10 chồi/cụm đã hình thành.
Như vậy, sau 5 tuần trên môi trường tạo đa chồi thì mới chỉ thu được 0-3 chồi từ mỗi mẫu vật, còn sau 8 tuần với một lần thay mới môi trường đã thu được các cụm chồi có hệ số chồi cao hơn (bảng
4.3). Có những mẫu vật không có chồi nào trước khi được cấy chuyển nhưng lại tạo cụm chồi sau khi cấy chuyển. Hầu hết các môi trường S cho tỉ lệ tạo đa chồi so với tổng số mẫu vật cấy chuyển cao, từ 80-93%. Do đó, trung bình tỉ lệ tạo cụm chồi có nhiều hơn 3 chồi là khá cao, so với tổng số đỉnh chồi trải qua cấy chuyển là 84% và so với tổng số phôi đưa vào là 57% (84 x 68%).
Từ bảng 4.2, tỉ lệ tạo cụm chồi đạt cao nhất trên môi trường S5 có 1 mg/L 2,4-D, 2 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA. Vậy môi trường S5 được chọn là môi trường tối ưu cho quy trình tạo đa chồi áp dụng cho biến nạp gen sau này.
Bảng 4.2: Kết quả hình thành chồi sau 5 tuần nuôi cấy Môi
trường mô sẹo hóa
Môi trường
tạo đa chồi
Tổng số đỉnh
chồi
Chết hoặc không
chồi
Đơn chồi
Cụm 2 chồi
Cụm 3 chồi
Chiều dài chồi
(cm) C4 14 2 8 0 4 1-1,2 C7 16 4 8 4 0 0,1-0,5 C3
S1
16 4 6 4 2 0,1-0,5 C10 16 2 6 4 4 0,1-0,5 C5 16 4 4 6 2 0,1-0,5 C16 16 6 2 6 2 0,1-0,5 C17 16 4 2 8 2 0,1-0,5 C13
S2
14 0 14 0 0 0,1-0,5 C18 16 6 6 4 0 0,1-0,5 C9 16 10 4 2 0 0,1-0,5 C14
S3
16 12 0 4 0 0,1-0,5 C11 16 10 4 2 0 0,1-0,5
C15 14 2 10 2 0 0,1-0,5 C19
S4
14 4 6 4 0 0,1-0,5 C20 16 0 4 8 4 0,1-0,5 C8 16 10 2 2 2 0,1-0,5 C12
S5
16 4 6 6 0 0,1-0,5
Tổng 264 84 92 66 22
25% 8%
Tỉ lệ tạo cụm 2 chồi và cụm 3 chồi tương ứng:
Tỉ lệ tạo cụm chồi sau 5 tuần (gồm cả 2 và 3 chồi): 32%
Tỉ lệ tạo chồi (kể cả đơn và đa chồi) sau 5 tuần: 68%
Bảng 4.3: Sự hình thành cụm chồi trên các môi trường S2-S5
Môi trường Số đỉnh chồi cấy
chuyển
Số cụm chồi > 2 chồi
Tỉ lệ tạo cụm chồi trên tổng số cấy chuyển
Số chồi trung bình
S2 36 30 83% 4
S3 45 36 80% 4
S4 40 32 80% 5
S5 42 39 93% 4
S2+S3+S4+S5 163 137 84% 4
Tỉ lệ tạo cụm chồi so với tổng số phôi: 57%
Một đặc điểm nữa đáng chú ý là chồi hình thành rất ngắn (0,1- 0,8cm), ít phát triển trên môi trường tạo đa chồi. Điều này là hợp lý vì môi trường tạo đa chồi có các hoóc môn sinh trưởng Kinetin và BAP có tác dụng chính làm cho các tế bào phân chia theo dạng tạo đa chồi.
iii) Sự kéo dài của chồi
Kết quả kéo dài chồi được thể hiện trong bảng 4.4. Các chồi kích thước từ 1 cm trở lên được coi là có cảm ứng kéo dài. Một số chồi hình thành rễ ngay trên những môi trường này.
Như vậy, là các môi trường không có hoóc môn hoặc có nồng độ hoóc môn Kinetin, BAP thấp (bảng 4.4) đã có tác dụng kéo dài chồi.
Các nghiên cứu của Perlak và CS chỉ ra rằng sự vắng mặt của hoóc môn sinh trưởng hỗ trợ sự phát triển của chồi tốt nhất, điều này cũng được thể hiện trong nghiên cứu của chúng tôi. Môi trường E0 cho tỉ lệ kéo dài chồi cao nhất là 30%, chứng tỏ rằng hàm lượng auxin và cytokinin nội sinh tạo ra trong quá trình hình thành và phát triển của chồi là rất lớn. Sự kết hợp của lượng hoóc môn nội sinh với lượng hoóc môn được bổ sung vào các môi trường E1 và E2 có thể đã ức chế chồi phát triển. Do vậy, môi trường E0 là môi trường tối ưu đối với sự phát triển chiều cao của chồi.
Bảng 4.4: Tỉ lệ kéo dài chồi và chiều cao chồi trên các môi trường E0-E2 Môi
trường
Số chồi được kích thích kéo dài
1 cm 2 cm ≥ 3 cm
Tỉ lệ chồi kéo dài
E0 33 3 4 3 30%
E1 39 2 4 2 21%
E2 44 2 3 1 13%
a b
a c
Hình 4.1: Quá trình tạo đa chồi từ phôi: (a) Phôi; (b) Đỉnh chồi; (c) Cụm chồi sau khi cấy chuyển
iv) Sự hình thành rễ
Theo Perlak và CS, môi trường 1/2 MS với một lượng nhỏ NAA hoặc không có NAA, đôi khi có thêm than hoạt tính đều cho ra tỉ lệ tạo rễ cao (Perlak và CS, 1990). Kết quả tạo rễ ở bảng 4.5 cũng rất tương tự, trên môi trường MS (không phải 1/2MS) với NAA, sự hình thành rễ diễn ra khá dễ dàng đối với chồi bông vì tỉ lệ cao. Đồng thời để ý rằng, trên môi trường kéo dài chồi không có chất điều khiển sinh trưởng E0, như đã nói ở trên, một số chồi đã hình thành rễ. Môi trường R1 với hàm lượng 0,2 mg/L NAA và 1g/L than hoạt tính cho sự tạo rễ tốt nhất là 100%.
Bảng 4.5: Tỉ lệ tạo rễ trên môi trường R1 và R2 Môi trường Số chồi được kích thích
tạo rễ Số chồi tạo rễ Tỉ lệ tạo rễ
R1 27 27 100%
R2 30 21 70%
Ngoài ra, có nghiên cứu đã chứng minh rằng chồi sau khi được kéo dài cũng có thể được trồng luôn ra đất, bỏ qua môi trường tạo rễ.
v) Quy trình tái sinh cây bông bằng tạo đa chồi
Kết hợp các kết quả trên đây, một quy trình tái sinh cây bông được thiết lập như sau: Phôi được tách từ hạt và đặt trên môi trường MS có 0,4 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA trong 10 ngày. Sau đó, cắt và nuôi cấy đỉnh chồi kích thước 2 mm trên môi trường tạo đa chồi có 1 mg/L Kinetin, 2 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA trong thời gian 8 tuần với một lần cấy chuyển, thu được các cụm chồi. Tiếp theo, môi trường không có hoóc môn sinh
trưởng được dùng để chồi phát triển chiều cao. Cuối cùng, chồi được tạo rễ trên môi trường có 0,2 mg/L NAA. Cây con được chuyển ra đất để thu được cây tái sinh hoàn chỉnh.
Tiếp tục áp dụng quy trình trên, chúng tôi thu được các kết quả tương tự với các giống LRA, VN36P, C118, D16-2, TM1, SSR, Cooker, SB1. Các kết quả cho thấy không có sự sai khác rõ rệt giữa các giống. Đây là cơ sở thuận lợi cho các thí nghiệm tiếp theo.
d) Kết luận về qui trình tái sinh cây bông qua cụm chồi
01. Đã nghiên cứu hoàn thiện được quy trình tái sinh in vitro ở cây bông bằng phương pháp tạo cụm đa chồi từ phôi 9 giống bông vải. Phôi bông được nuôi cấy trên môi trường MS có tổ hợp 0,4 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA, sau đó đỉnh chồi được cấy chuyển lên môi trường có 1 mg/L Kinetin, 2 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA để tạo cụm chồi.
Chồi phát triển kéo dài trên môi trường không có chất điểu khiển sinh trưởng. Sau cùng, một lượng rất nhỏ NAA được dùng để kích thích tạo rễ. Kết quả này khẳng định một triển vọng cho việc khắc phục những khó khăn của việc tái sinh theo con đường tạo phôi sôma ở loại cây khó nuôi cấy này.
02. Tỉ lệ tạo cụm chồi và số lượng chồi khá cao chứng tỏ tính khả thi của công tác chuyển nạp gen vào cây bông. Quy trình đang áp dụng để biến nạp gen thông qua Agrobacterium.
4.2.2.Tái sinh cây bông qua phôi soma a) Các giống bông
Hạt của các giống bông SB1, TM1, SSR 60F, 254, LRA 5166, VN36P, C118A do Viện Nghiên cứu Cây Bông cung cấp.
b) Phương pháp nghiên cứu
i) Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Trong thí nghiệm này, tất cả các môi trường đều xuất phát từ môi trường cơ bản (MS0), chỉ khác nhau ở thành phần và hàm lượng các chất điều khiển sinh trưởng. Môi trường cơ bản đó gồm các muối MS đa lượng, vi lượng theo Murashige và Skoog, 9g/L thạch, vitamin B5 theo Gamborg, 0,75 g/L MgCl2,, 30 g/L glucoza. Tất cả
các bình nuôi cấy đều được đặt trong điều kiện nhiệt độ 25±2oC và chế độ chiếu sáng 8h/24h với cường độ ánh sáng 2.000 lux.
ii) Khử trùng hạt và chuẩn bị nguyên liệu tạo mô sẹo
Bảng 4.6: Thành phần các môi trường cảm ứng tạo mô sẹo Thành phần chất điều khiển sinh trưởng Các loại môi trường và
tên môi trường 2,4-D (mg/L)
Kinetin (mg/L)
Zeatin (mg/L)
NAA (mg/L) MS1 0,10 0,10 không có không có MS2 0,20 0,10 không có không có MS3 0,40 0,10 không có không có MS4 0,10 0,20 không có không có MS5 0,20 0,20 không có không có MS6 0,40 0,20 không có không có MS7 0,10 0,40 không có không có MS8 0,20 0,40 không có không có MS9 0,40 0,4 0 không có không có MSR1 không có 0,50 không có 0,50 MSR2 không có 0,50 không có 1,00 MSR3 không có 0,50 không có 1,50 MSR4 không có 0,50 không có 2,00 MSR5 không có 0,50 không có 2,50 MSR6 không có 0,50 không có 3,00
MSC1 không có không có 0,10 0,01 MSC2 không có không có 0,50 0,01 MSC3 không có không có 1,00 0,01 MSC4 không có không có 2,00 0,01 MSC5 không có không có 0,10 0,05 MSC6 không có không có 0,50 0,05 MSC7 không có không có 1,00 0,05 MSC8 không có không có 2,00 0,05 MSC9 không có không có 0,10 0,10 MSC10 không có không có 0,50 0,10 MSC11 không có không có 1,00 0,10 Tổ hợp loại 1
Tổ hợp loại 2
Tổ hợp loại 3
MSC12 không có không có 2,00 0,10
Hạt bông sau khi tách sợi được lột bỏ lớp lông ngắn bằng H2SO4 đậm đặc, xả nước cho thật sạch, thấm khô bằng giấy thấm khử trùng, hạt được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phút, tiếp theo lắc trong dung dịch javen 60% trong 20-25 phút và rửa nhiều lần bằng nước cất khử trùng đến khi nước trong. Cuối cùng hạt được thấm khô bằng giấy thấm vô trùng.
Cấy lên môi trường đặt hạt là môi trường cơ bản MS0 như nêu ở trên. Khi cây non được 10-15 ngày tuổi thì bắt đầu tiến hành lấy nguyên liệu tạo mô sẹo.
iii) Cảm ứng tạo mô sẹo
Nguyên liệu tạo mô sẹo gồm các đoạn thân mầm dài 1 cm và mảnh lá mầm diện tích khoảng 16 mm2. Chúng tôi xem xét khả năng cảm ứng tạo mô sẹo của các môi trường nuôi cấy có bổ sung tổ hợp các chất điều khiển sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau (bảng 4.6), thuộc 1 trong 3 loại tổ hợp sau:
Kết hợp 2,4 Dichlorophenoxyacetic axít (2,4-D) và Kinetin;
kết hợp Kinetin và 1-Naphthyl acetic axít (NAA) và kết hợp Zeatin và NAA. Đánh giá khả năng cảm ứng mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.
iv) Nhân và duy trì mô sẹo
Bảng 4.7: Thành phần các môi trường nhân và duy trì mô sẹo
Thành phần chất điều khiển sinh trưởng Môi trường
cảm ứng mô sẹo
Môi trường nhân mô sẹo tương ứng 2,4-D
(mg/L)
Kinetin (mg/L)
Zeatin (mg/L)
NAA (mg/L)
MS1 0,10 0,10 - - MS2 0,20 0,10 - - MS3 0,40 0,10 - - MS4 0,10 0,20 - - MS5 0,20 0,20 - - MS6 0,40 0,20 - - MS7 0,10 0,40 - - MS8 0,20 0,40 - - MS9 0,40 0,4 0 - - NMSa 0,10 0,10 - - NMSb 0,05 0,05 - - Tổ hợp loại 1
MS0 - - - - MSR1 - 0,50 - 0,50 MSR2 - 0,50 - 1,00 MSR3 - 0,50 - 1,50 MSR4 - 0,50 - 2,00 MSR5 - 0,50 - 2,50 Tổ hợp loại 2
MSR6 - 0,50 - 3,00
NMSRa - 0,25 0,25 NMSRb - - 0,5 MS0 - - - - MSC1 - - 0,10 0,01 MSC2 - - 0,50 0,01 MSC3 - - 1,00 0,01 MSC4 - - 2,00 0,01 MSC5 - - 0,10 0,05 MSC6 - - 0,50 0,05 MSC7 - - 1,00 0,05 MSC8 - - 2,00 0,05 MSC9 - - 0,10 0,10 MSC10 - - 0,50 0,10 MSC11 - - 1,00 0,10 MSC12 - - 2,00 0,10 NMSCa - - 0,10 0,01 NMSCb - 0,01 Tổ hợp loại 3
MS0 - -
Sau 4 tuần, chuyển tất cả các mẫu vật đã mô sẹo hóa lên môi trường nhân và duy trì mô sẹo vẫn giữ nguyên nồng độ các chất điều khiển sinh trưởng tương ứng (MS1-MS9; MSR1-MSR9;
MSC1-MSC9); hoặc có nồng độ các chất điều khiển sinh trưởng tương ứng ở nồng độ rất thấp (NMSa, b, NMSRa, b; NMSCa, b);
hoặc loại bỏ hoàn toàn chất điều khiển sinh trưởng (MS0). Cách bố trí này (bảng 4.7) sẽ cho phép đánh giá ảnh hưởng của lượng hoóc môn sinh trưởng lên sự duy trì mô sẹo và phân hóa phôi. Sau 4 tuần, cấy chuyển toàn bộ mô sẹo lên môi trường MS0, và tiếp tục cấy chuyển sau mỗi 4 tuần. Ví dụ: mô sẹo hình thành trên môi trường MS1 được cấy chuyển lên 4 loại môi trường là MS1, NMSa, NMSb và MS0. Bốn tuần sau, cấy chuyển toàn bộ những mô sẹo đó lên MS0 và tiếp tục thay môi trường MS0 sau 4 tuần.
Điều đáng chú ý là khối mô sẹo được giữ nguyên và cấy chuyển chứ không cắt nhỏ như đối với một số đối tượng khác.
v) Sự hình thành phôi và tái sinh cây
Sau 2-4 lần cấy chuyển như vậy, một số khối mô sẹo có sự hình thành và phát triển của phôi. Chúng tôi gọi môi trường nhân và duy trì mô sẹo cuối cùng được cấy chuyển khi phôi hình thành là môi trường cảm ứng tạo phôi. Như vậy, trong thí nghiệm này môi
trường cảm ứng tạo phôi có thành phần giống như môi trường nhân và duy trì mô sẹo MS0. Sau khi phôi hình thành, tiếp tục cấy chuyển phôi lên môi trường nảy mầm phôi/tái sinh cây cũng là môi trường cơ bản (MS0) không có chất điều khiển sinh trưởng.
vi) Ra cây từ ống nghiệm vào đất
Khi cây được 8-10 cm thì tiến hành đưa cây ra điều kiện tự nhiên. Trước hết, những bình tam giác có cây được đưa ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ ngoài trời trong 3 ngày để cây thích nghi trước khi chuyển sang bầu đất. Ba công thức của bầu đất được thử nghiệm là 100% cát; 1/2cát:1/2 đất; và 1/3 đất:1/3 cát:1/3 trấu toàn tính. Sau 4 tuần thì chuyển cây sang chậu lớn chỉ chứa đất và chăm sóc theo quy trình của Viện Nghiên cứu Cây Bông. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây tái sinh trong nhà lưới.
c) Kết quả tạo phôi soma i) Cảm ứng tạo mô sẹo
Đối với tất cả các giống bông nghiên cứu, mọi tổ hợp chất điều khiển sinh trưởng đều tạo mô sẹo tỉ lệ cao nhưng phát triển tương đối kém (bảng 4.8).
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của các tổ hợp hoóc môn sinh trưởng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo và phôi soma của các giống bông SSR60F, 254 và VN36P
Số mẫu vật Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mô sẹo tạo
phôi (%) Sự phát triển của mô sẹo Loại tổ
hợp Môi trường
Loại mẫu
vật SSR 254 VN36P SSR 254 VN36P SSR 254 VN36P SSR 254 VN36P MS1 thân
mầm lá mầm
46 32
50 30
50 30
60 70
50 51
70 70
0 0
0 0
0 0
+ +
+ +
++
++
Tổ hợp loại 1
MS2 thân mầm lá mầm
49 32
50 30
50 30
80 75
66 72
82 83
0 0
0 0
0 0
+ ++
+ +
++
++
MS3 thân mầm lá mầm
63 32
30 50
30 50
100 75
90 95
90 100
0 0
0 0
0 0
++
++
++
++
++
++
MS4 thân mầm lá mầm
48 32
50 30
50 30
79 78
63 67
70 70
7 0
0 0
0 0
++
++
+ +
++
++
MS5 thân mầm lá mầm
35 33
50 30
50 30
78 85
79 78
71 75
8 0
0 0
0 0
+ ++
+ +
++
++
MS6 thân mầm lá mầm
30 34
30 50
30 50
100 95
80 79
80 90
0 0
0 0
0 0
+++
+++
++
++
++
++
MS7 thân mầm lá mầm
37 32
50 30
50 30
75 87
53 54
69 81
0 0
0 0
0 0
++
++
+ +
++
++
MS8 thân mầm lá mầm
30 32
50 30
50 30
79 97
68 70
90 90
0 0
0 0
0 0
++
++
+ +
++
++