1.4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH VẬT
1.4.1. Nhân sinh khối vi sinh vật và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối vi sinh vật
Từ các chủng vi sinh vật được tuyển chọn, người ta tiến hành nhân sinh khối vi sinh vật theo phương pháp lên men chìm hoặc lên men xốp. Trong đó, vi sinh vật được nhân sinh khối trong các điều kiện phù hợp với từng chủng loại vi sinh vật và mục đích sử dụng. Các chế phẩm vi sinh vật được sản xuất từ vi khuẩn được tạo ra chủ yếu bằng phương pháp lên men chìm.
Kỹ thuật lên men chìm có sục khí và khuấy trộn hay kỹ thuật lên men bề sâu là phương pháp lên men hiếu khí trong môi trường lỏng, trong đó quá trình lên men xảy ra trong toàn bộ thể tích khối dịch. Đây là kỹ thuật lên men điển hình trong công nghệ lên men hiện đại. Kỹ thuật này có rất nhiều ưu điểm, đặc biệt là khả năng tiếp xúc giữa vi sinh vật với môi trường, độ đồng đều trong toàn bộ khối dịch và khả năng cơ giới hóa, tự động hóa trong quá trình thuận lợi hơn so với phương phương lên men bề mặt. Do hàm lượng của oxy trong không khí thấp và oxy hòa tan rất kém trong nước nên để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho vi sinh vật người ta áp dụng đồng thời hai giải pháp là vừa sục khí vừa khuấy trộn hợp lý (Lê Văn Nhương và cs, 2009).
1.4.1.1. Dinh dưỡng
Vi sinh vật cũng như các loài động thực vật khác, chúng luôn có nhu cầu sử dụng các nguồn dinh dưỡng để duy trì các hoạt động sống. Các chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật là những chất chúng có thể hấp thụ từ môi trường xung quanh và được sử dụng làm nguyên liệu để cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lượng. Tuy nhiên, không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy đều được coi là chất dinh dưỡng. Chất dinh dưỡng phải là những chất có tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào (Lương Đức Phẩm, 2010).
Thực tế cho thấy, thành phần môi trường lên men có vai trò rất quan trọng, quyết định đến năng lực và hiệu quả của quá trình lên men (Lê Văn Nhương và cs, 2009; Nguyễn Lân Dũng và cs, 2008). Các nguồn các bon thường được bổ sung vào môi trường là bột ngũ cốc, cám mỳ, cám gạo, rỉ đường, hoặc các loại đường manito, dextrin, glyxerin, sacaroza. Nguồn thức ăn nitơ có thể là bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, pepton, các muối NO3
- , NH4
+. Các nguyên tố khoáng đa lượng thường phốt pho, lưu huỳnh, magiê, sắt, canxi, kali, natri. Các nguyên tố vi lượng thường là Cu, Co, molipden, … (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2008). Tuy nhiên, nồng độ, thành phần của các môi trường dùng để nhân sinh khối vi sinh vật còn phụ thuộc vào đặc điểm sinh trưởng, phát triển của từng loài trong các chi cũng như phương pháp sử dụng để nhân sinh khối (Martin Dworkin et al., 2006). Theo Martin Dworkin et al. (2006), mật độ chủng Bradyrhizobium nuôi cấy trên môi trường AG, đạt >108 CFU/ml )g). Kết quả của Phạm văn Toản và cộng sự cũng cho thấy: Khi nuôi cấy trên môi trường YGB, mật độ tế bào chủng Bradyrhizobium japonicum đạt 108 CFU/ml.
Trong sản xuất công nghiệp, môi trường dinh dưỡng chuẩn thường không được sử dụng vì giá thành cao. Các nhà sản xuất đã phải tìm ra môi trường thay thế từ các nguồn nguyên liệu sẵn có (Lê Văn Nhương và cs, 2009). Ví dụ: Rỉ đường làm nguồn dinh dưỡng các bon; rỉ đường có chứa nhiều thành phần khoáng chất có tác dụng tích cực đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Cao nấm men là nguồn cung cấp nitơ, đồng thời là yếu tố sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật. Tuy nhiên, đây là loại nguyên liệu đắt tiền, nhập khẩu từ nước ngoài; do đó ảnh hưởng lớn đến giá thành sản phẩm. Sử dụng nước chiết đậu, nước chiết thịt bò, bột thủy phân nấm men làm nguồn cung cấp nitơ đã và đang được ứng dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2003).
1.4.1.2. pH
Trong số các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến chức phận sống của tế bào trước hết phải kể nồng độ ion hidro. pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động mạnh nhất trong tất cả các ion, những biến đổi rất nhỏ của chúng cũng tạo ra những biến đổi rất mạnh mẽ. Theo Zhang H. et al. (2006), pH của môi trường không những ảnh hưởng mạnh mẽ lên quá trình sinh trưởng mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình trao đổi chất. Do vậy, việc xác định thích hợp ban đầu và việc duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là vô cùng quan trọng (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2008).
Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) rất cần thiết cho sự sinh trưởng, sinh sản của vi sinh khuẩn, tương ứng với các giá trị pH cần nhiều cho hoạt động của nhiều enzym. Giới hạn pH hoạt động đối với hoạt động của vi sinh vật trong khoảng 4 - 10. Đa số vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất ở pH trung bình (pH = 7,0). Theo Meghvasi K. et al (2005), Skivakuma et al. (2012), Bradyrhizobium japonicum có khả năng tồn tại ở pH 4,2 - 9,0 và sinh trưởng tối ưu ở pH 6,8 - 7,0.
1.4.1.3. Nhiệt độ
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào. Tế bào thu được nhiệt chủ yếu là do quá trình trao đổi chất với môi trường bên ngoài, một phần cũng do cơ thể thải ra do quá trình trao đổi chất (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2008).
Vi sinh vật thường bị giới hạn trong môi trường chứa nước ở dạng có thể hấp thụ. Hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật thường bị chết ở nhiệt độ cao, protein bị biến tính, hàng loạt enzym bị bất hoạt. Các enzym hô hấp
đặc biệt là enzym trong chu trình Krebs rất mẫn cẩm với nhiệt độ (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2008).
Nhiệt độ thấp có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất do sự thay đổi của một số permaeza chứa trong màng hoặc ảnh hưởng hoặc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dưỡng (Zhang H. et al., 2003). Các nhóm vi sinh vật khác nhau có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Theo Badawin F. Sh. F.
et al. (2011), điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của Bradyrhizobium là 26 - 30 oC.
1.4.1.4. Tỷ lệ tiếp giống
Trong quá trình nhân giống, thường khi giống phát triển đến nửa sau hoặc nửa cuối sau của giai đoạn phát triển lũy thừa thì sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân giống kế tiếp với tỷ lệ cấy chuyển khoảng 1 - 10 %.
Tùy thuộc quy mô sản xuất, quá trình nhân giống có thể kéo dài qua nhiều chu kỳ cấy chuyền cho đến khi đủ lượng giống cung cấp cho cho mỗi mẻ lên men (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2008).
1.4.1.5. Oxy
Tế bào sử dụng lượng oxy để hô hấp và làm giảm lượng oxy trong môi trường. Vì thế trong nuôi cấy hiếu khí phải cung cấp oxy một cách đều đặn.
Thiếu oxy nhất định tại một thời điểm nào đó trong môi trường dẫn đến sự phá vỡ quá trình trao đổi chất của tế bào. Tăng oxy đến giới hạn nhất định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng lên theo.
Độ oxy hòa tan còn phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ các hợp chất hợp phần và độ nhớt của môi trường. Khi nhiệt độ tăng lên thì độ hòa tan của oxy giảm. Độ hòa tan của oxy giảm khi nhiệt độ tăng đến 30 - 37 oC. Điều này có thể khắc phục bằng cách cho sục khí mạnh hơn trong quá trình lên
men. Nồng độ oxy hòa tan cũng sẽ giảm khi dung các chất hoạt động bề mặt, chất phá bọt và sinh khối vi sinh vật tăng lên.
Trong quá trình nuôi cấy, không khí nén được thổi vào thùng lên men có hệ thống cánh khuấy. Tốc độ sục khí mạnh sẽ tăng tốc độ hòa tan oxy và trộn đều cơ chất dinh dưỡng môi trường. Nhưng không nên khuấy mạnh vì ảnh hưởng đến sự hư hỏng cơ học của các tế bào dẫn đến hiện tượng tự phân (Lê Văn Nhương và cs, 2009).
Ở trong nước, nồng độ hòa tan bão hòa ở 30 oC khoảng 7,7 mg/lít, chỉ sau khoảng vài giây vi sinh vật hấp thu hết. Do đó, trong kỹ thuật lên men chìm, nhu cầu cung cấp oxy cho quá trình lên men thường rất lớn. Để đảm bảo cung cấp oxy trong suốt quá trình lên men, người ta phải khai thác đồng thời hai yếu tố là lượng cấp khí lớn và cải thiện điều kiện tiếp xúc giữa hai pha lỏng và pha khí bằng cách sục khí kết hợp bơm đảo hay khuấy trộn tích cực trong quá trình lên men.
Như vậy, việc lựa chọn chế độ cấp khí và tốc độ cánh khuấy trộn, trong điều kiện vẫn đảm bảo hiệu quả cho quá trình trao đổi chất tạo sản phẩm của vi sinh vật và với chi phí hợp lý về năng lượng, là một chỉ tiêu công nghệ quan trọng cấu thành nên chi phí sản xuất chung cho sản phẩm. Các thông số công nghệ này được xác định tương ứng cho từng quá trình lên men cụ thể và có điều khiển phù hợp từ lúc bắt đầu đến khi kết thúc quá trình lên men.
Trong quá trình sản xuất, việc kiểm tra và điều chỉnh các yếu tố môi trường (pH, nhiệt độ, oxy, tốc độ khí, …) là hết sức cần thiết (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2003).