3.2. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT PHÙ HỢP CHO CÂY LẠC TRÊN ĐẤT CÁT BIỂN TỈNH BÌNH ĐỊNH
3.2.2. Định tên của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Với mục tiêu tạo một sản phẩm thân thiện với môi trường, an toàn với con người và động thực vật cũng như chất lượng nông sản, đề tài đã tiến hành định tên và xác định độ an toàn sinh học đối với các chủng VSV tuyển chọn.
3.2.2.1. Chủng vi khuẩn cố định nitơ RA18
Bảng 3.11. Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng RA18 STT Đặc điểm hình thái, sinh hóa Thông số
1 Hình thái khuẩn lạc Sau 120 giờ nuôi cấy trên môi trường YMA, không bắt màu công gô đỏ, hình tròn, hơi lồi, trơn, bóng, đường kính khuẩn lạc 1,5 - 2,0 mm.
2 Đặc điểm tế bào Hình que, đứng riêng lẻ, kích thước 0,65 - 2,5àm
3 Gram -
4 Sinh bào tử -
5 Khả năng chuyển động +
6 Oxydaza +
7 Catalaza +
8 Ureaza +
9 Đồng hóa nitrat +
Thủy phân
10 Cazein -
11 Gelatin +
12 Tinh bột +
13 Urê +
Sử dụng
14 L-Rhamnoza -
15 D-Glucosamin -
16 D-Alanin -
17 Axit malonic +
Sinh axit từ
18 L-Arabinoza +
19 D-Glucoza +
20 D-Mannoza +
21 D-Manitol +
22 Sacaroza +
23 D-Fructoza -
24 Lactoza -
Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính.
Căn cứ vào kết quả đánh giá đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hóa so với khóa phân loại Bergey của (Pau D. V., 2005 và George G. M. ), chủng vi khuẩn cố định nitơ RA18 có nhiều đặc điểm giống loài Bradyrhizobium japonicum.
Để khẳng định chính xác về tên loài của chủng vi khuẩn cố định nitơ RA18, bằng kỹ thuật sinh học phân tử, đề tài đã tiến hành giải trình tự gen 16S ARN riboxom của chủng RA18. Kết quả so sánh trình tự gen 16S ARN riboxom của vi khuẩn cố định nitơ RA18 với trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank cho thấy chủng RA18 có độ tương đồng 99,9 % (1333/1335) so với loài Bradyrhizobium japonicum USDA 6.
RA 18
Bradyrhizobium japonicum strain USDA 6_gi|631251355|
Bradyrhizobium daqingense strain CCBAU 15774_gi|645321755|
Rhodopseudomonas harwoodiae strain JA531_gi|566084942|
Nitrobacter hamburgensis strain X14_gi|444303891|
Methylocapsa acidiphila strain B2_gi|265678618|
100
43 98
0.01
Hình 3.1 Vị trí phân loại của chủng RA18 và các loài có quan hệ họ hàng gần 3.2.2.2. Chủng vi khuẩn phân giải phốt phát khó tan P1107
Bảng 3.12. Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng P1107
STT Đặc điểm sinh học Thông số
1 Hình thái khuẩn lạc Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường King B, khuẩn lạc màu trắng đục, về già chuyển màu hơi vàng, dạng hình tròn, lồi, bóng, bề mặt thô, đường kính khuẩn lạc 2 - 3 mm
2 Đặc điểm tế bào Hình que, đứng riêng lẻ hay từng chuỗi, kớch thước 0,6 x 1,6 àm
3 Gram +
4 Sinh bào tử +
5 Khả năng chuyển động +
6 Oxydaza +
7 Catalaza +
8 Ureaza +
9 Đồng hóa nitrat +
Thủy phân
10 Cazein +
11 Gelatin +
12 Tinh bột +
13 Urê -
Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính.
Bảng 3.13. Khả năng sử dụng nguồn các bon đối với chủng P1107 theo kít chuẩn API 50 CHB
TT Cơ chất phản ứng
Bacillus megaterium
Chủng
P1107 TT Cơ chất phản ứng
Bacillus megaterium
Chủng P1107
1 Đối chứng - - 26 Aesculin + +
2 Glycerol + + 27 Salicin + +
3 Erythritol - - 28 Cellobioza + +
4 D-Arabinoza - - 29 Maltoza + +
5 L-Arabinoza + + 30 Lactoza + +
6 Riboza + + 31 Melibioza + +
7 D- Xyloza + + 32 Saccaroza + +
8 L- Xyloza - - 33 Trehaloza + +
9 Adonitol - - 34 Inulin + +
10 -Methyl-D- Xylosit
- -
35 Melezitoza w +
11 Galactoza + + 36 D-Raffinoza + +
12 D-Glucoza + + 37 Tinh bột + +
13 D-Fructoza + + 38 Glycogen + +
14 D-Manoza w - 39 Xylitol w -
15 L-Sorboza - - 40 β-Gentiobioza + +
16 Rhamnoza - - 41 D-Turanoza + +
17 Dulcitol - - 42 D-Lyxoza - -
18 Inositol + + 43 D-Tagatoza - -
19 Mannitol + + 44 D-Fucoza - -
20 Sorbitol w + 45 L-Fucoza - -
21 α-Methyl-D- Mannosit
- -
46 D-Arabitol + +
22 α-Methyl-D- Glucosit
+ +
47 L-Arabitol - -
23 N-Acetyl- Glucosamin
+ +
48 Gluconat w -
24 Amygdalin + +
49 2-Keto-
Gluconat - -
25 Arbutin + + 50 5-Keto-
Gluconat - -
Chú thích: (+) dương tính, (w) dương tính yếu, (-) âm tính.
Căn cứ vào kết quả đánh giá đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hóa so với khóa phân loại của Paul D. V. et all và George M. G. (2005), chủng vi khuẩn phân giải phốt phát khó tan P1107 có nhiều đặc điểm giống loài Bacillus megaterium.
Kết quả so sánh trình tự gen 16S ARN riboxom của vi khuẩn phân giải phốt phát khó tan P1107 với trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank cho thấy chủng P1107 có độ tương đồng 99,9 % (1543/1544) so với loài Bacillus megaterium AC46b1.
P1107
Bacillus megaterium isolate_AC46b1 Bacillus megaterium strain ATCC 14581 Bacillus cohnii strain DSM 6307
Bacillus asahii strain MA001
Bacillus_kochii strain WCC 4582 Bacillus shackletonii strain LMG_18435 Bacillus acidicola strain 105-2
99
48 100 91
81
0.005
Hình 3.2. Vị trí phân loại của chủng P1107 và các loài có quan hệ họ hàng gần 3.2.2.3. Chủng vi khuẩn hòa tan kali S3.1
Bảng 3.14. Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng S3.1
STT Đặc điểm sinh học Thông số
1 Hình thái khuẩn lạc Sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường Aleksandrov, khuẩn lạc màu vàng, tròn, trong, lồi, nhẵn, nhầy, đường kính khuẩn lạc 6 - 8 mm.
2 Đặc điểm tế bào Hình que, đứng riêng lẻ, kích thước 0,8 x 3,2 àm
3 Gram +
4 Sinh bào tử +
5 Khả năng chuyển động +
6 Oxydaza +
7 Catalaza +
8 Ureaza -
9 Đồng hóa nitrat -
Thủy phân
10 Cazein -
11 Gelatin +
12 Tinh bột +
13 Urê -
Bảng 3.15. Khả năng sử dụng nguồn các bon đối với chủng S3.1 theo kít chuẩn API 50 CHB
TT Cơ chất phản ứng
P.
castaneae
Chủng
S3.1 TT Cơ chất phản ứng
P.
castaneae
Chủng S3.1
1 Đối chứng - - 26 Aesculin v -
2 Glycerol - - 27 Salicin w w
3 Erythritol - - 28 Cellobioza - -
4 D-Arabinoza 29 Maltoza + +
5 L-Arabinoza + + 30 Lactoza w +
6 Riboza - - 31 Melibioza + +
7 D- Xyloza + + 32 Saccaroza + +
8 L- Xyloza - - 33 Trehaloza + +
9 Adonitol - - 34 Inulin v -
10 -Methyl-D- Xylosit
+ +
35 Melezitoza - -
11 Galactoza + + 36 D-Raffinoza + +
12 D-Glucoza + + 37 Tinh bột v +
13 D-Fructoza - - 38 Glycogen - -
14 D-Mannoza + + 39 Xylitol - -
15 L-Sorboza - -
40 β-
Gentiobioza + +
16 Rhamnoza + + 41 D-Turanoza + +
17 Dulcitol - - 42 D-Lyxoza - -
Paenibacillus catalpae strain D75 Paenibacillus glycanilyticus strain NBRC 16618
Paenibacillus xinjiangensis strain B538 S3.1
Paenibacillus castaneae strain Ch-32 0.010
0.006 0.003 0.001
0.012
0.006 0.003
0.004
0.002
18 Inositol - - 43 D-Tagatoza - -
19 Mannitol + + 44 D-Fucoza - -
20 Sorbitol - - 45 L-Fucoza - -
21 α-Methyl-D- Mannosit
- -
46 D-Arabitol - -
22 α-Methyl-D- Glucosit
- -
47 L-Arabitol - -
23 N-Acetyl- Glucosamin
- -
48 Gluconat + +
24 Amygdalin - -
49 2-Keto-
Gluconat v -
25 Arbutin v - 50 5-Keto-
Gluconat v -
Chú thích: (+) dương tính, (w) dương tính yếu, (-) âm tính, (v) không xác định Căn cứ vào kết quả đánh giá đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hóa so với khóa phân loại Bergey (Paul D. V. et all, 2005 và George M. G. et all, 2005), chủng vi khuẩn hòa tan kali S3.1 có nhiều đặc điểm giống loài Paenibacillus castaneae.
Kết quả so sánh trình tự gen 16S ARN riboxom của vi khuẩn hòa tan kali S3.1 với trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank cho thấy chủng S3.1 có độ tương đồng 98,5 % (1425/1446) so với loài Paenibacillus castaneae Ch-32.
Hình 3.3. Vị trí phân loại của chủng S3.1 và các loài có quan hệ họ hàng gần
3.2.2.4. Chủng nấm men sinh polysaccarit PT5.1
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào: Sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường Hansen, khuẩn lạc màu trắng đục, dạng hình tròn, chảy, bề mặt bóng, mịn, nhầy, nhớt. Tế bào hình cầu to, nảy chồi một phía, có chứa giọt lipít lớn, nang chứa nhiều bào tử.
Bảng 3.16. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của chủng nấm men PT5.1
STT
Các test thử sinh lý,
sinh hóa
L.
starkeyi
PT5.1 STT
Các test thử sinh lý,
sinh hóa
L.
starkeyi
PT5.1
Lên men
1 Glucoza - - 34 -Methyl-D-
Glucosit + +
2 Galactoza - - 35 Salicin v +
3 Sacaroza - - 36 Nitrat - +
4 Maltoza - - 37 DL-Lactat - -
5 Lactoza - - 38 Succinat w/+ +
6 Melibioza - - 39 Citrate w/+ +
7 Raffinoza - - 40 Inositol v -
Đồng hóa C 41 D-Gluconat v -
8 Glucoza + + 42 D-Glucosamin - -
9 Galactoza + + Đồng hóa Nitơ
10 L-Sorboza + + 43 (NH4)2 SO4 + +
11 Sacaroza + + 44 KNO3 - -
12 Maltoza + + 45 NaNO2 - -
13 Cellobioza + + 46 Ethylamin v +
14 Trehaloza + + 47 L-Lysin v +
15 Lactoza v - 48 Biotin v +
16 Melibioza + + 49 Pant + +
17 Raffinoza + + 50 Folic axit + -
18 Melezitoza + + 51 Inocitol + +
19 Inulin + + 52 Niacin + +
20 Tinh bột v + 53 Pyridoxin + +
21 D-Xyloza + + 54 Riboflavin v +
22 L-Arabinoza v - 55 Thiamin + +
23 D-Arabinoza v - Test thử khác
24 D-Riboza v - 56 Sinh trưởng ở
50% Glucoza - -
25 L-Rhamnoza v - 57 Tạo thành tinh
bột v -
26 Methanol - - 58 Gelatin hóa - -
27 Ethanol + + 59 Ureaza - -
28 Glycerol v + 60 Lipaza - -
29 Erythritol v - 61 Tạo thành axit - -
30 Ribitol v - 62 Sinh trưởng ở
25 oC + +
31 Galactitol v - 63 Sinh trưởng ở
30 oC + +
32 D-Mannitol + + 64 Sinh trưởng ở
35 oC v +
33 D-Glucitol + + 65 Sinh trưởng ở
40 oC - -
Ghi chú: (+) dương tính, (w) dương tính yếu, (-) âm tính, (v) không ổn định
Căn cứ vào kết quả đánh giá đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hóa so với khóa phân loại của Maudy T. S. và Cletus P. K. (2011), chủng nấm men sinh polysaccarit PT5.1 có nhiều đặc điểm giống loài Lipomyces starkeyi.
Kết quả so sánh trình tự gen 28S ARN riboxom của chủng nấm men sinh polysaccarit PT5.1 với các trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank cho thấy chủng PT 5.1 có độ tương đồng 99,4 % (503/506) so với loài nấm men Lipomyces starkeyi NBRC 106975.
Pt 5.1
gi|426206545|dbj|AB760326.1| Lipomyces starkeyi genes for 18S rRNA ITS1 5.8S rRNA ITS2 and 26S rRNA partial and complete sequence strain: NBRC 106975 gi|4038923|gb|U84235.1|LKU84235 Lipomyces kononenkoae subsp. kononenkoae 26S ribosomal RNA gene partial sequence
gi|419590274|dbj|AB747650.1| Lipomyces doorenjongii genes for ITS1 5.8S rRNA ITS2 26S rRNA complete and partial sequence strain: CBS 7542 gi|4038924|gb|U84237.1|LKU84237 Lipomyces kononenkoae subsp. spencermartinsiae 26S ribosomal RNA gene partial sequence gi|506948428|dbj|AB726597.1| Lipomyces lipofer gene for large subunit ribosomal RNA partial sequence strain: NIP006 gi|27316970|gb|U40137.2|DUU40137 Dipodascopsis uninucleata var. uninucleata 26S ribosomal RNA gene partial sequence gi|4090553|gb|U76353.1|MUU76353 Myxozyma udenii 26S ribosomal RNA gene partial sequence
gi|419590280|dbj|AB747656.1| Lipomyces mesembrius genes for ITS1 5.8S rRNA ITS2 26S rRNA complete and partial sequence strain: CBS 7661 0.0000
0.0000
19.4091
0.0000 0.0123
0.0061
0.0000 0.0417 0.0180 0.0576
0.0165
0.0020 0.0124
0.0000 0.0006
Hình 3.4. Vị trí phân loại của chủng PT5.1 và các loài có quan hệ họ hàng gần Độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật sử dụng trong đời sống có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Dựa vào sự phân định mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật của WHO, Úc, Canada, Bỉ, cộng đồng châu Âu (theo Amerian Biological Safety Assosiation and Sciencetifix Institute of Public Health, Divisiton of Biosafety and Biotechnology, Belgium), nhóm tác nhân sinh học được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong đó chỉ các vi sinh vật ở cấp độ 1 và được sử dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thường.
Mức an toàn sinh học 1: Mức thích hợp cho các công việc có liên quan tới các tác nhân sinh học đã được mô tả kỹ về đặc điểm, không gây bệnh hoặc có tiềm năng gây hại ở mức tối thiểu đối với con người và môi trường.
Mức an toàn sinh học 2: Tương tự mức 1 và thích hợp cho các tác nhân sinh học có tiềm năng gây hại ở mức độ trung bình đối với con người và môi trường.
Mức an toàn sinh học 3: Áp dụng cho tác nhân bản xứ hoặc ngoại lai có thể gây bệnh và gây hại nặng cho người do phơi nhiễm qua đường không khí.
Mức an toàn sinh học 4: Yêu cầu đối với công việc có liên quan đến các tác nhân nguy hiểm, ngoại lai có khả năng lây nhiễm qua đường không khí và gây bệnh, gây hại làm đe dọa đến tính mạng.
Dựa vào kết quả định tên các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu và đối chiếu với danh mục các loài vi sinh vật an toàn của Cộng đồng châu Âu cũng như danh mục các loài vi sinh vật bị hạn chế sử dụng cho thấy các chủng vi sinh vật được lựa chọn được xếp vào nhóm vi sinh vật có độ an toàn thuộc mức độ 1. Các chủng vi sinh vật lựa chọn có thể sử dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh vật.
Tổng hợp kết quả xác định tên đến loài và mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được trình bày trong bảng 3.17.
Bảng 3.17. Tổng hợp kết quả xác định tên đến loài và mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
STT Ký hiệu chủng vi sinh vật
Tên chủng vi sinh vật
Mức độ an toàn
1 RA18 Bradyrhizobium japonicum 1
2 P1107 Bacillus megaterium 1
3 S3.1 Paenibacillus castaneae 1
4 PT5.1 Lipomyces starkeyi 1
Dựa trên kết quả ở các bảng trên và so sánh với điều kiện nhiệt độ, pH và độ mặn của đất cát biển tại Cát Trinh và Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định cho thấy bốn chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng thích hợp với điều kiện về nhiệt độ, pH và độ mặn của đất cát biển tại tỉnh Bình Định. Bốn chủng vi sinh vật tuyển chọn chọn được xếp vào nhóm vi sinh vật có độ an toàn thuộc mức độ 1. Các chủng vi sinh vật lựa chọn có thể sử dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh vật.
Hình 3.5. Khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủng RA18
Hình 3.6. Khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủng P1107
Hình 3.7. Khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủng S3.1
Hình 3.8. Khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủng PT5.1
A
A
A
B
B
B
A B
M RA18 RA18 P1107 P1107 S3.1 N P
Hình 3.9. Kết quả PCR đoạn gen mã hoá phần tử 16S ARN riboxom của các chủng vi khuẩn
PT5.1 N M P
Hình 3.10. Kết quả PCR đoạn gen mã hóa phần tử 18S ARN riboxom của chủng nấm men PT5.1
Chú thích: M: Maker, N: Đối chứng âm, P: Đối chứng dương
0,5kb