CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật
Các vi sinh vật hữu ích được phân lập trên môi trường thạch đĩa chứa môi trường thích hợp với từng nhóm hoạt tính (vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh, phân giải phốt phát khó tan, hòa tan kali, nấm men tổng hợp polysaccarit), cụ thể như sau:
Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh (Beck D. P. et al, 1993 và FNCA, 2006)
Lấy nốt sần hữu hiệu từ rễ cây lạc, rửa sạch bằng nước cất để loại bỏ đất, sau đó rửa lại bằng nước khử trùng 2 - 3 lần; khử trùng bề mặt nốt sần bằng cách ngâm ngập trong cồn 70o trong 30 giây, tiếp theo trong natri hypochlorit 3% trong 3 phút. Sau khi rửa lại bằng nước khử trùng 4 - 5 lần, nốt sần được vào ống eppendof chứa 100 μl glycerol 15 % và được nghiền nát để thu được dịch vi sinh vật.
Cấy dịch vi sinh vật lên đĩa petri chứa môi trường chứa môi trường YMA có bổ sung công gô đỏ được chuẩn bị sẵn và tiến hành nuôi ở 28 - 30oC trong 5 - 7 ngày.
Thu nhận các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch đĩa, tiếp tục cấy vạch trên môi trường thạch đĩa chứa môi trường YMA có bổ sung công gô đỏ để thu được các khuẩn lạc thuần.
Vi khuẩn phân giải phốt phát khó tan (TCVN 6167:1996)
Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %) đã được khử trùng; lắc trên máy lắc 30 phút, sau đó để lắng;
dùng pipetman hút 1 ml dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, thu được dịch pha loãng mẫu có nồng độ pha loãng là 10-2; tiếp tục pha loãng để thu được dịch pha loãng mẫu có nồng độ pha loãng là 10-3, 10-4.
Cấy 100 μl dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, lên đĩa petri chứa môi trường Pikovskaya đã chuẩn bị sẵn và tiến hành nuôi ở 28 - 30 oC trong 3 - 5 ngày.
Từ các vi khuẩn phân giải phốt phát khó tan (vi khuẩn tạo vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc - vòng phân giải Ca3(PO4)2), tiếp tục cấy cấy vạch trên thạch đĩa chứa môi trường Pikovskaya để thu được các khuẩn lạc thuần.
Vi khuẩn hòa tan kali (Cao Ngọc Diệp, 2010)
Phương pháp phân lập vi khuẩn hòa tan kali được tiến hành tương tự như phân lập vi khuẩn phân giải phốt phát, trong đó thay thế môi trường Pikovskaya bằng môi trường Aleksandrov cải tiến. Thu nhận các khuẩn lạc tạo vòng trong suốt (vòng phân giải fenspat) bao quanh khuẩn lạc.
Tiếp tục cấy cấy vạch trên thạch đĩa chứa môi trường Aleksandrov cải tiến để thu được các khuẩn lạc thuần.
Nấm men polysaccarit (Nguyễn Kiều Băng Tâm, 2009)
Các mẫu đất được nghiền nhỏ, trộn với nước khử trùng tạo thành cụm đất và đặt lên mặt thạch chứa môi trường Hansen trong các đĩa petri đã chuẩn bị sẵn với khoảng cách giữa các cụm đất là 1 cm. Để ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bổ sung vào môi trường trước khi đổ đĩa thạch 80 mg streptomixin/lít môi trường. Nuôi ở 28 - 30 oC, sau 4 tuần, quan sát sự hình thành màng nhầy ở các cụm đất.
Từ các cụm đất tạo màng nhầy, tiếp tục cấy pha loãng bằng kỹ thuật cấy vạch trên thạch đĩa chứa môi trường Hansen để thu được các khuẩn lạc thuần.
2.3.2.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của các vi sinh vật phân lập
Cố định nitơ cộng sinh
Khả năng cố định nitơ cộng sinh của vi sinh vật tuyển chọn được đánh giá thông qua khả năng hình thành nốt sần hữu hiệu và hoạt tính cố định nitơ trên cây chủ.
Thí nghiệm trồng cây được tiến hành trong điều kiện nhà lưới, trên cát khử trùng, 1 kg cát/chậu, 6 lần nhắc (3 lần nhắc để đếm số lượng nốt sần hữu hiệu và 3 lần nhắc để đo lượng etylen tạo thành).
Công thức thí nghiệm:
CT1: Nhiễm dịch vi sinh vật (1 ml dịch VSV (mật độ 108 CFU/ml)/hạt) CT2: Đối chứng (nhiễm 1 ml môi trường nuôi cấy VSV/hạt).
Phân bón (cho 1 chậu):
Dung dịch trồng cây*: 10 ml + Ca(HPO4)2: 0,21 g + CaCO3: 0,67 g.
* Thành phần dung dịch trồng cây:
KCl 10 g
MgSO4 . 7 H2O 8,2 g
NH4NO3 1,6 g
H3BO4 0,17 g
MnSO4 0,17
(NH4)6Mo7O24 . 4 H2O 0,482 g
Nước cất 660 ml
Chỉ tiêu đánh giá: Khi cây nở hoa rộ, đếm số lượng nốt sần hữu hiệu trên cây và tiến hành lấy mẫu cây để xác định khả năng cố định nitơ của vi khuẩn bằng cách đo lượng etylen tạo thành trên máy sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa (TCVN 8564:2010).
Phân giải phốt phát khó tan
Khả năng phân giải phốt phát khó tan của vi sinh vật phân lập được xác định định tính thông qua đường kính vòng phân giải Ca3(PO4)2 trên môi trường thạch đĩa Pikovskaya theo TCVN 6167:1996 và định lượng thông qua hàm lượng phốt pho hữu hiệu trong dịch nuôi cấy theo TCVN 8565:2010.
Hòa tan kali
Khả năng hòa tan kali của vi sinh vật phân lập được xác định định tính thông qua đường kính vòng phân giải khoáng fenspat trên thạch đĩa chứa môi trường Aleksandrov cải tiến và định lượng thông qua hàm lượng kali tan trong dịch nuôi cấy chứa khoáng fenspat theo phương pháp quang kế ngọn lửa (Cao Ngọc Điệp, 2010 và TCVN 10785:2015).
Khả năng sinh polysaccarit
- Khả năng tổng hợp polysaccarit của vi sinh vật phân lập được xác định thông qua độ nhớt của dịch nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường Hansen sau 2 - 3 ngày nuôi ở nhiệt độ 28 - 30 oC trên máy lắc ở tốc độ 150 vòng/phút (Nguyễn Kiều Băng Tâm, 2009). Độ nhớt được đo trên máy đo độ nhớt Elcometer 2300, sử dụng phần mềm Viscosity MasterTM.
- Xác định lượng polysaccarit tạo thành: Lấy 30 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật, rót từ từ cồn tuyệt đối, vừa rót vừa khuấy cho đến khi polysaccarit kết tủa hoàn toàn. Lượng cồn dùng để kết tủa có thể bằng 1, 2 hoặc 3 lần dịch nuôi cấy (tùy theo độ nhầy của dịch nuôi cấy các chủng). Lọc qua giấy lọc, sấy ở 105 oC đến khối lượng không đổi. Lượng polysaccarit được tính bằng hiệu số của mẫu sấy trừ đi khối lượng khô ban đầu của giấy lọc.
2.3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật đến khả năng hấp thụ dinh dưỡng, sinh trưởng và năng suất của cây lạc
Thí nghiệm bố trí trong nhà lưới, có mái che, theo khối ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại, trồng 3 hạt/chậu (hạt được ủ trước khi trồng), 10 kg đất+cát/chậu (tỷ lệ đất : cát là 50 : 50). Sử dụng giống lạc LDH01.
Công thức thí nghiệm: Gồm đối chứng: Không nhiễm vi sinh vật trên nền phân bón NPK đầy đủ (30 kg N, 60 kg P2O5 và 90 kg K2O/ha; tương đương 0,64 g urê, 2,5 g supe lân, 0,5 g kali clorua/chậu) và thí nghiệm:
Nhiễm riêng rẽ hoặc hỗn hợp các vi sinh vật trên nền phân bón đầy đủ và
giảm bớt 10, 20, 30% lượng phân đạm, lân hoặc kali theo hoạt tính cố định nitơ, phân giải phốt phát khó tan, hòa tan kali của vi sinh vật tuyển chọn hoặc bón đầy đủ và giảm 10, 20, 30% lượng phân khoáng NPK đối với thí nghiệm sử dụng hỗn hợp các vi sinh vật, nhiễm 1 ml dịch vi sinh vật (mật độ 108 CFU/ml)/hạt.
Các chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng N, P2O5, K2O tổng số trong sinh khối chất xanh, chiều cao cây (cm), sinh khối chất xanh (g khô/chậu) và năng suất quả khô (g/chậu). Phương pháp đánh giá được trình bày tại mục 2.3.6 và 2.3.8.
2.3.2.4. Đánh giá khả năng giữ ẩm đất của vi sinh vật tổng hợp polysaccarit
Thí nghiệm nhà lưới
Thí nghiệm bố trí trong nhà lưới, có mái che, theo khối ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại, 10 kg đất+cát/chậu (tỷ lệ đất : cát là 50 : 50).
Công thức thí nghiệm gồm đối chứng bổ sung mỗi chậu 10 ml môi trường Hansen đã khử trùng và thí nghiệm bổ sung mỗi chậu 10 ml dịch nuôi cấy nấm men có mật độ 108 CFU/ml. Các chậu thí nghiệm được tưới nước đạt độ ẩm 40 %, sau đó để bốc hơi nước tự nhiên và không tưới nước suốt thời gian thí nghiệm.
Xác định độ ẩm đất ở tầng 5 - 20 cm vào các thời điểm 0, 15, 30, 45 và 60 ngày kể từ khi bắt đầu thí nghiệm.
Thí nghiệm đồng ruộng:
Sử dụng phương pháp tưới khung theo phương pháp Kachinski cải tiến (Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, 1998).
Thí nghiệm được thực hiện tại Cát Trinh, Phù Cát, Bình Định
Sử dụng khung vuông, khung ngoài có kích thước 100 x 100 cm, khung trong 50 x 50 cm, chiều cao khung 20 cm.
Thí nghiệm bố trí ba lần lặp.
Công thức thí nghiệm:
CT1: Đối chứng (không nhiễm vi sinh vật)
CT2: Bổ sung dịch vi sinh vật, lượng 20 ml (108 CFU/ml)/ô.
Đổ đầy nước sạch vào các khung, lấy rơm tủ kín toàn bộ trên khung.
Sau 24 giờ, dỡ rơm, nhấc 2 khung ra; lấy mẫu đất ở độ sâu 5 cm vào gần tâm của khung để xác định độ ẩm.
2.3.2.5. Xác định mật độ vi sinh vật
Mật độ các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy, trong chế phẩm vi sinh vật, trong đất trồng lạc được xác định theo TCVN 6166:2002 đối với vi sinh vật cố định nitơ, TCVN 6167:1996 đối với vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan và TCVN 8275-2:2010 đối với nấm men. Mật độ vi sinh vật hòa tan kali được xác định theo Cao Ngọc Điệp (2010) và TCVN 10785:2015.
2.3.2.6. Đánh giá khả năng thích hợp với đất cát biển Bình Định của các vi sinh vật phân lập
Nhiệt độ
Cấy các chủng vi sinh vật RA18, P1107, S3.1, PT5.1 trong các bình tam giác chứa môi trường tương ứng với từng chủng vi sinh vật, nuôi trên máy lắc ở các nhiệt độ 20±1, 25±1, 30±1, 35±1 oC; Sau 5 ngày nuôi cấy đối với chủng RA18 và 2 ngày nuôi cấy đối với chủng P1107, S3.1, PT5.1, xác định mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi cấy theo phương pháp được trình bày tại mục 2.3.2.4.
pH
Điều chỉnh pH của các môi trường nuôi cấy các chủng RA18, P1107, S3.1, PT5.1 bằng các axit axetic 0,08 M, axit phốtphoric 0,08 M, axit boric và NaOH 0,4 N đảm bảo môi trường có pH ban đầu là 4,5, 5,0, 5,5 và 6,0.
Cấy các chủng vi sinh vật RA18, P1107, S3.1, PT5.1 trong các bình tam giác chứa môi trường tương ứng với từng chủng vi sinh vật, có giá trị pH
ban đầu đã chuẩn bị ở trên, nuôi cấy trên máy lắc ở nhiệt độ 28-30 oC. Sau 5 ngày nuôi cấy đối với chủng RA18 và 2 ngày nuôi cấy đối với chủng P1107, S3.1, PT5.1, xác định mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi cấy theo phương pháp được trình bày tại mục 2.3.2.4.
Độ mặn
Bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy các chủng RA18, P1107, S3.1, PT5.1 đảm bảo môi trường có nồng độ NaCl ban đầu là 0,2; 0,4 và 0,6 ‰.
Cấy các chủng vi sinh vật RA18, P1107, S3.1, PT5.1 trong các bình tam giác chứa môi trường tương ứng với từng chủng vi sinh vật, đã bổ sung NaCl để có các nồng độ NaCl ban đầu đã chuẩn bị ở trên. Sau 5 ngày nuôi cấy đối với chủng RA18 và 2 ngày nuôi cấy đối với chủng P1107, S3.1, PT5.1, xác định mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi cấy theo phương pháp được trình bày tại mục 2.3.2.4.
2.3.2.7. Định tên các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Định tên theo kỹ thuật truyền thống
Các vi sinh vật tuyển chọn được định tên ban đầu theo khóa phân loại Bergey (George M. G. et al., 2005) và Yarrow D., 1998.
- Xác định đặc điểm hình thái, sinh hóa: Nhuộm gram, đặc điểm khuẩn lạc, khả năng hình thành bào tử, phản ứng catalaza, các đặc điểm sinh hóa được thực hiện theo các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học thông thường. Hình ảnh tế bào được quan sát trên kính hiển vi điện tử quét.
- Xác định khả năng đồng hóa các nguồn hydratcacbon: Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường cơ bản (dạng dịch thể) đặc hiệu với từng chủng ở điều kiện thích hợp, thay thế các nguồn hydratcacbon khác nhau.
Dựa trên sự chuyển biến màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng dương tính hay âm tính.
- Định tên chủng P1107 và S3.1 bằng kít API50 CHB, đọc kết quả sau 48 giờ; so sánh với ngân hàng cơ sở dữ liệu API profile index bằng phần mềm API-WEB để xác định tên loài.
Định tên bằng kỹ thuật sinh học phân tử:
Xác định trình tự gen 16S ARN riboxom của chủng vi khuẩn theo hướng dẫn của hãng sản xuất Kit và tham khảo theo phương pháp của Sambrook J. và Russell D.W. (2009); Cletus P. K. và Christie J. R. (1998).
Trên cơ sở giải trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom (đối với vi khuẩn) hoặc 28S ARN riboxom (đối với nấm men), so sánh trình tự đoạn gen 16S/28S ARN riboxom của vi sinh vật nghiên cứu với cơ sở dữ liệu GenBank theo phần mềm BLAST, xây dựng cây phát sinh chủng loại và và tên loài vi sinh vật được xác định với xác suất tương đồng cao nhất.
Phương pháp, kỹ thuật sử dụng gồm các bước sau:
Tách ADN tổng số
Tách ADN tổng số của các mẫu vi khuẩn cần định danh bằng bộ kit Genomic DNA Purification Kit của Fermentas. Trình tự tiến hành theo quy trình hướng dẫn của hãng:
- Ly tâm mẫu vi khuẩn 5000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi;
- Thêm 200 μl TE 1X, trộn đều hỗn hợp tránh tạo bọt;
- Thêm 400 μl dung dịch lysis và ủ ở 65 oC trong 10 phút;
- Thêm 600 μl dung dịch chloroform vào ống đã ủ, lắc nhẹ vài lần;
- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút;
- Hút toàn bộ dịch trên sang ống mới và thêm 800 μl dung dịch tủa ADN (720 μl dung dịch H2O khử ion + 80 μl dung dịch Supplied 10X). Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút;
- Ly tâm, loại dịch nổi. Hòa tủa ADN trong 100 μl dung dịch NaCl 1,2 M.
Thêm 2 μl RNAse 10mg/ml, ủ 37 oC trong 1 giờ;
- Thêm 300 μl cồn tuyệt đối vào ống và để -20 oC trong 3 giờ hoặc qua đêm;
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa. Rửa tủa hai lần bằng cồn 70o; - Thêm 500 μl cồn 70o, trộn đều;
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút;
- Làm khô ADN bằng máy hút chân không hoặc làm khô tự nhiên trong box sạch;
- Hòa tủa ADN trong 50μl TE 1X. Bảo quản ở -20 oC;
Phản ứng khuếch đại ADN (PCR)
Nguyên tắc: Phương pháp này sử dụng ADN polymeraza và các oligonucleotit tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khuôn được nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỷ lần mà không cần đến nhiều tế bào vi khuẩn.
Cách tiến hành:
Thành phần phản ứng
Thành phần Thể tích (l)
Đệm 10X 2,5
MgCl2 25 mM 1,5
dNTP 2 mM 2,5
Mồi xuụi (10 pmol/àl) 1,0
Mồi ngược (10 pmol/àl) 1,0 Taq polymeraza (1,5 U/l) 1,0
ADN khuôn 2,0
H2O 13,5
Chu trình nhiệt
94 oC: 3 phút;
94 oC: 20 giây;
58 oC: 30 giây;
72 oC: 45 phút;
72 oC: 15 phút;
Lặp lại 35 chu trình
4 oC: Giữ tới khi điện di Primer cặp mồi (Fermentas - Pháp).
- Đối với vi khuẩn
Mồi xuôi: 27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
Mồi ngược: 1492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′
- Đối với nấm men
Mồi xuôi: ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′
Mồi ngược: ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
Kiểm tra các sản phẩm PCR bằng điện di
Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2 ml, nước cất 98 ml, agroza 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300 ml dung dịch 1 X TAE, trộn 2 àl dung dịch 6X với 5à mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng, chạy điện di bằng dòng điện 1 chiều với điện thế 100 V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
Tinh sạch sản phẩm PCR: Sử dụng bộ kit QIAquick Gel (QG) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Thêm QG vào mẫu với lượng 3 thể tích QG:1 thể tích gel (100 mg tương đương 100 àl);
- Đem ủ hỗn hợp ở 50 oC trong 10 phút đến khi màu của hỗn hợp chuyển sang vàng;
- Cho thêm 1 thể tích izopropanol vào mẫu và trộn đều;
- Dùng Eppendoff cột (có màng lọc) đặt vào trong một Eppendoff 2 ml thường khác. Cho hỗn hợp mẫu lên cột và tiến hành ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút;
- Hút bỏ dung dịch bên dưới, chèn cột lại;
- Thêm 0,5 ml QG và ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút;
- Rửa cột bằng 0,75 ml PE, để 2-5 phút rồi lại tiến hành ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút;
- Hút bỏ dịch bên dưới và ly tâm lại để dịch xuống hết;
- Rút cột ra và chèn vào ống Eppendoff sạch, sau đó dùng nước cất hoặc dung dịch TE cho chảy nhẹ qua lưới lọc để hoà tan ADN bám trên lưới.
Thu sản phẩm PCR sạch và dùng để giải trình tự.
- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Kiểm tra độ hấp phụ trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 nm và 280 nm. ADN sạch khi tỷ lệ A260/A280 >1,7.
Đọc trình tự ADN và xây dựng cây phân loại
Sản phẩm PCR gen mã hóa phần tử 16S/28S sau khi được tinh sạch tiến hành đọc trình tự bằng bộ BigDye Terminator V.3.1 Cycle Sequencing kit trên máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ).
Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal X. Các trình tự được so sánh với trình tự ADN riboxom 16S/28S của các loài đã được công bố từ dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Xây dựng cây phát sinh, phân tích Bootstrap được thực hiện từ 1.000 lần lặp lại ngẫu nhiên. Tên loài vi sinh vật được xác định với xác suất tương đồng cao nhất.
2.3.2.8. Đánh giá khả năng hỗn hợp của các chủng vi sinh vật
Đánh giá khả năng hỗn hợp của các chủng VSV thông qua khả năng tương tác của các chủng VSV trên thạch đĩa và đánh giá khả năng nâng cao hiệu quả sử dụng đạm, lân, kali của hỗn hợp các chủng VSV trên cây lạc.
Đánh giá khả năng tương tác của các chủng VSV trên thạch đĩa: Bốn chủng vi sinh vật nghiên cứu được nuôi cấy trên thạch đĩa với môi trường thạch thịt theo phương pháp cấy vạch tạo các điểm tiếp xúc giữa các chủng.
Theo dõi và đánh giá khả năng ức chế phát triển của các chủng VSV tại điểm