3.3. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT CHO CÂY LẠC TRÊN ĐẤT CÁT BIỂN
3.3.1. Nhân sinh khối vi sinh vật
Trong công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật, quá trình nhân sinh khối vi sinh vật là một trong các yếu tố quyết định đến chất lượng sản phẩm.
Để đáp ứng mục tiêu xây dựng qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật, luận án đã tiến hành nghiên cứu một số điều kiện thích hợp cho quá trình nhân sinh khối các chủng vi sinh vật như: Môi trường, pH, nhiệt độ, tỷ lệ tiếp giống cấp I, mức độ cấp khí, tốc độ cánh khuấy và thời gian nhân sinh khối.
Lựa chọn các thông số kỹ thuật cho nhân sinh khối các chủng vi sinh vật dựa trên các tiêu chí: Vi sinh vật sinh trưởng ở giai đoạn đầu của pha cân bằng, mật độ tế bào đạt >108 CFU/ml, tiết kiệm thời gian nhân giống và giá thành sản phẩm.
Chủng Bradyrhizobium japonicum RA18 có nguồn gen từ quỹ gen vi sinh vật, đã có các thông số kỹ thuật thích hợp cho nhân sinh khối như sau:
Môi trường nhân sinh khối: YGB; pH: 7,0; nhiệt độ 30 oC; lưu lượng cấp khí:
0,65 lít KK/lít MT/phút; tốc độ cánh khuấy: 300 vòng/phút; tỷ lệ tiếp giống cấp I: 5% và thời gian nhân sinh khối: 72 h. Do đó, luận án kế thừa các kết quả trên trong nhân sinh khối chủng Bradyrhizobium japonicum RA18 và tiếp tục nghiên cứu, lựa chọn điều kiện nhân sinh khối thích hợp cho ba chủng vi sinh vật còn lại trong bộ chủng giống được tuyển chọn.
3.3.1.1. Môi trường nhân sinh khối thích hợp
Thành phần môi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sống và duy trì hoạt tính sinh học của vi sinh vật; các chủng vi sinh vật khác nhau thích hợp sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy khác nhau. Bên cạnh đó, việc lựa chọn sử dụng các môi trường thay thế rẻ tiền, dễ kiếm còn có ý nghĩa quan trọng giúp mang lại hiệu quả kinh tế; đặc biệt khi sản xuất ở quy mô công nghiệp. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật sử dụng được trình bày trong hình 3.12 và phụ lục 3.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của môi trường nhân sinh khối đến mật độ tế bào các chủng vi sinh vật
Kết quả ở hình 3.12 và phụ lục 3 cho thấy:
- Chủng P1107: Sinh trưởng tốt trên cả ba môi trường nuôi cấy (mật độ tế bào vi sinh vật đạt 2,1 x 108 - 1,0 x 109 CFU/ml); sinh trưởng tốt nhất trên môi trường SX Ba (mật độ tế bào vi sinh vật đạt 1,0 x 109 CFU/ml). Tuy nhiên môi trường SX Ba có giá thành sản xuất cao. Vì vậy, môi trường SX2 được lựa chọn cho sản xuất nhân sinh khối chủng P1107 (mật độ tế bào đạt 8,4 x 108 CFU/ml).
- Chủng S3.1: Sinh trưởng tốt trên môi trường SX5 và Alexsandrov.
Sau 48 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt >3,5 x 108 CFU/ml. Tuy nhiên, mật độ tế bào của chủng S3.1 trên môi trường SX5 cao hơn trên môi trường Alexsandrov. Môi trường SX5 được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng S3.1 (mật độ tế bào đạt 8,3 x 108 CFU/ml).
- Chủng PT5.1: Sinh trưởng tốt trên môi trường SX3 và môi trường Hansen (mật độ tế bào đạt 5,6 x 108 - 6,8 x 108 CFU/ml). Tuy nhiên, môi trường SX3 có giá thành sản xuất thấp hơn môi trường Hansen. Môi trường SX3 được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng PT5.1.
3.3.1.2. Lựa chọn pH thích hợp
pH có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật.
Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có những ảnh hưởng mạnh mẽ.
Các loại vi sinh vật khác nhau có khả năng thích nghi với các điều kiện pH khác nhau. Để xác định pH tối ưu cho các chủng vi sinh vật sử dụng, luận án đã đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trong cùng một điều kiện về môi trường, nhiệt độ, mức độ cấp khí, tốc độ cánh khuấy, tỷ lệ tiếp giống, thời gian nuôi cấy và điều chỉnh pH môi trường ở các pH khác nhau. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của điều kiện pH tới mật độ tế bào của các chủng VSV sử dụng được thể hiện trong hình 3.13 và phụ lục 3.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến mật độ tế bào các chủng vi sinh vật Kết quả ở hình 3.13 và phụ lục 3 cho thấy:
- Chủng P1107: Tương tự như chủng RA18, chủng P1107 sinh trưởng tốt ở điều kiện pH 6,0 - 7,5 mật độ tế bào đạt 3,0 - 8,2 x 108 CFU/ml. Chủng P1107 sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện pH 7,0 (mật độ tế bào đạt 8,2 x 108 CFU/ml). pH 7,0 được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng P1107.
- Chủng S3.1: Sinh trưởng tốt ở điều kiện pH từ 6,0 đến 7,5; mật độ tế bào đạt >2,1 - 7,5 x 108 CFU/ml. Ở pH 7,0, mật độ tế đạt cao nhất; pH 7,0 được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng S3.1 (mật độ tế bào đạt 7,5 x 108 CFU/ml).
- Chủng PT5.1: Sinh trưởng tốt ở điều kiện pH 6,0 - 7,0 (mật độ tế bào đạt >1,2 - 6,6 x 108 CFU/ml); sinh trưởng tốt nhất ở pH 6,5 (mật độ tế bào đạt 6,6 x 108 CFU/ml). pH 6,5 được lựa chọn cho sinh khối chủng PT5.1.
3.3.1.3. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng của vi sinh vật, đặc biệt ảnh hưởng tới hoạt động của những enzym do chúng sản sinh ra trong quá trình hoạt động. Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với nhiệt độ nhất định để sinh trưởng và tạo sản phẩm. Vì vậy, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Để xác định nhiệt độ thích hợp cho các
chủng vi sinh vật, chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trong cùng một điều kiện về môi trường, pH, mức độ cấp khí, tốc độ cánh khuấy, tỷ lệ tiếp giống cấp I, thời gian nuôi cấy và điều chỉnh nhiệt độ nuôi cấy ở nhiệt độ khác nhau. Kết quả được thể hiện trong hình 3.14 và phụ lục 3.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật độ tế bào các chủng vi sinh vật Kết quả ở hình 3.14 và phụ lục 3 cho thấy:
- Chủng P1107: Tương tự chủng RA18, chủng P1107 sinh trưởng tốt ở ba nhiệt độ nghiên cứu (mật độ tế bào đạt 4,8 - 8,3 x 108 CFU/ml). Ở nhiệt độ 30 oC, mật độ tế bào đạt cao nhất (8,3 x 108 CFU/ml). Nhiệt độ 30 oC được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng P1107.
- Chủng S3.1: Sinh trưởng tốt ở nhiệt 25 - 35 oC (mật độ tế bào đạt 2,5 - 8,0 x 108 CFU/ml). Mật độ tế bào chủng S3.1 đạt cao nhất khi nuôi cấy ở 30 oC (đạt 8,0 x 108 CFU/ml). Nhiệt độ 30 oC được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng S3.1.
- Chủng PT5.1: Sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ 25 - 30 oC (mật độ tế bào đạt 3,2 - 6,4 x 108 CFU/ml). Tuy nhiên mật độ tế bào của chủng PT5.1 đạt cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 30 oC (mật độ tế bào đạt 6,4 x 108 CFU/ml).
3.3.1.4. Lựa chọn lưu lượng cấp khí thích hợp
Trong quá trình nhân giống, các chủng vi sinh vật đều có nhu cầu ôxy.
Nếu thiếu hay thừa ôxy, sẽ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào và nhu cầu ôxy là không giống nhau ở các chủng vi sinh vật. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành đánh giá nhu cầu sử dụng ôxy trong quá trình sinh trưởng của các chủng vi sinh vật thông qua lượng không khí cấp vào. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của lưu lượng cấp khítrong quá trình nhân sinh khối đối với các chủng vi sinh vật được thể hiện ở hình 3.15 và phụ lục 3.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của lưu lượng cấp khí đến mật độ tế bào các chủng vi sinh vật
Kết quả hình 3.15 và phụ lục 3 cho thấy:
- Chủng P1107: Ở lưu lượng cấp khí là 0,7 lít không khí/lít môi trường/phút, mật độ tế bào chủng P1107 đạt cao nhất (8,6 x 108 CFU/ml).
Lưu lượng cấp khí 0,7 lít không khí/lít môi trường/phút được lựa chọn cho nhân giống chủng P1107.
- Chủng S3.1: Sinh trưởng tốt ở bốn ngưỡng lưu lượng cấp khí nghiên cứu (mật độ tế bào đạt 1,5 - 8,4 x 108 CFU/ml). Ở lưu lượng khí 0,75 lít không khí/lít môi trường/phút, mật độ tế bào vi sinh vật đạt cao nhất (đạt 8,4 x 108 CFU/ml). Tuy nhiên, để tiết kiệm chi phí, lưu lượng cấp khí 0,70 lít
không khí/lít môi trường/phút được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng S3.1 (mật độ tế bào đạt 8,0 x 108 CFU/ml).
- Chủng PT5.1: Sinh trưởng tốt nhất ở lưu lượng cấp khí là 0,65 - 0,70 lít không khí/lít môi trường/phút, mật độ tế bào đạt 6,4 - 6,6 x 108 CFU/ml.
Để tiết kiệm chi phí sản xuất, lưu lượng cấp khí 0,65 lít không khí/lít môi trường/phút được lựa chọn cho nhân giống chủng PT5.1.
3.3.1.5. Lựa chọn tốc độ cánh khuấy thích hợp
Trong quá trình nhân sinh khối, tốc độ cánh khuấy ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hòa tan ôxy, sự hòa tan các thành phần dinh dưỡng, khả năng tiếp xúc giữa ôxy, chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được thể hiện ở hình 3.16 và phụ lục 3.
Hình 3.16. Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến mật độ tế bào các chủng vi sinh vật
Kết quả ở hình 3.16 và phụ lục 3 cho thấy: Chủng P1107 và PT5.1 đều sinh trưởng tốt ở tốc độ cánh khuấy 250 - 400 vòng/phút. Mật độ tế bào chủng P1107 và PT5.1 đạt cao nhất ở 350 vòng/phút (đạt lần lượt là 8,5 x 108 CFU/ml và 8,0 x 108 CFU/ml). Chủng S3.1 sinh trưởng tốt ở tốc độ cánh khuấy trong khoảng 300 - 400 vòng/phút. Mật độ tế bào chủng S3.1 đạt cao nhất ở 300 vòng/phút (đạt 6,5 x 108 CFU/ml). Từ các kết quả trên, đề tài lựa
chọn tốc độ cánh khuấy thích hợp cho nhân sinh khối chủng PT5.1 là 300 vòng/phút và chủng P1107, S3.1 là 350 vòng/phút.
3.3.1.6. Lựa chọn tỷ lệ tiếp giống cấp I thích hợp
Tỷ lệ tiếp giống cấp I có ảnh hưởng đến mật độ tế bào vi sinh vật của dịch lên men, đồng thời liên quan đến giá thành sản phẩm. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống cấp I đến mật độ tế bào của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được thể hiện trong hình 3.17 và phụ lục 3.
Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống cấp I đến mật độ tế bào các chủng vi sinh vật
Kết quả ở hình 3.17 và phụ lục 3 cho thấy:
- Chủng P1107: Khi bổ sung giống cấp I với tỷ lệ 3% và 5%, mật độ tế bào đạt 1,5 - 8,3 x 108 CFU/ml. Tuy nhiên, để đảm bảo mật độ tế bào sau khi nhiễm vào chế phẩm đạt >108 CFU/ml, tỷ lệ tiếp giống cấp I 5% được lựa chọn cho nhân giống chủng P1107 (mật độ tế bào đạt 8,3 x 108 CFU/ml).
- Chủng S3.1: Tương tự chủng P1107, tỷ lệ tiếp giống cấp I thích hợp cho giống là 5% (mật độ tế bào đạt 7,8 x 108 CFU/ml).
- Chủng PT5.1: Khi bổ sung giống cấp I với tỷ lệ 3% và 5%, mật độ tế bào có sự sai khác không đáng kể, đạt 6,8 - 7,2 x 108 CFU/ml. Do đó, để tiết
kiệm chi phí, giảm giá thành sản xuất, tỷ lệ tiếp giống cấp I là 3% được lựa chọn cho nhân giống chủng PT5.1 (mật độ tế bào đạt 6,8 x 108 CFU/ml).
Kết quả trên tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng (2008), Phạm Văn Toản (2005, 2007): Tỉ lệ giống cấp I bổ sung vào quá trình lên men từ 1,0 % đến 10 % tùy thuộc vào từng chủng giống vi sinh vật.
3.3.1.7. Lựa chọn thời gian nhân sinh khối thích hợp
Mỗi chủng vi sinh vật có đường cong sinh trưởng khác nhau. Vì vậy, lựa chọn thời gian lên men thích hợp cho các chủng vi sinh vật nhằm đảm bảo mật độ vi sinh vật đạt tối ưu và tiết kiệm chi phí sản xuất là công việc cần thiết trong quá trình lựa chọn điều kiện lên men nhân giống. Để xác định thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men nhân giống các chủng vi sinh vật sử dụng, chúng tôi đã tiến hành lên men nhân giống các chủng vi sinh vật trong hệ thống lên men nhân giống tự động có cùng điều kiện môi trường, pH, nhiệt độ, lưu lượng cấp khí và ở thời gian nuôi cấy khác nhau. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của thời gian lên men đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được thể hiện ở hình 3.18 và phụ lục 3.
Hình 3.18. Ảnh hưởng của thời gian đến mật độ tế bào các chủng VSV Kết quả ở hình 3.18 và phụ lục 3 cho thấy:
- Chủng P1107: Sau 24 - 60 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt 1,6 - 8,5 x 108 CFU/ml. Thời gian nuôi cấy thích hợp cho chủng vi sinh vật trong quá trình nhân sinh khối là thời gian mà tế bào vi sinh vật sinh trưởng ở giai đoạn đầu của pha cân bằng; đồng thời tiết kiệm được thời gian và chi phí sản xuất.
Do đó, thời gian được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng P1107 là 36 giờ (mật độ tế bào đạt 8,2 x 108 CFU/ml).
- Chủng S3.1: Tương tự chủng P1107, sau 24 - 60 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt >1,0 - 8,2 x 108 CFU/ml; mật độ tế bào đạt cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy (đạt 8,2 x 108 CFU/ml). Tuy nhiên, để tiết kiệm thời gian và chi phí sản xuất, thời gian nuôi cấy 36 giờ được lựa chọn cho nhân sinh khối chủng S3.1 (mật độ tế bào đạt 8,0 x 108 CFU/ml).
- Chủng PT5.1: Sau 36-60 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào chủng PT5.1 đạt 4,5 - 6,8 x 108 CFU/ml. Mật độ tế bào chủng PT5.1 đạt cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy (đạt 6,8 x 108 CFU/ml), sau đó mật độ tế bào giảm. Tuy nhiên, mật độ tế bào chủng PT5.1 sau nuôi cấy 36 giờ đạt tương đương với mật độ tế bào sau 48 giờ nuôi cấy. Với mục đích lựa chọn thời gian nhân sinh khối thích hợp, đảm bảo mật độ tế bào trong chế phẩm đạt yêu cầu và giảm giá thành sản phẩm, chúng tôi lựa chọn thời gian nhân sinh khối chủng PT5.1 là 36 giờ (mật độ tế bào đạt 6,6 x 108 CFU/ml).
Từ các kết quả trên, luận án đã lựa chọn được điều kiện thích hợp cho nhân sinh khối các chủng vi sinh vật tuyển chọn. Kết quả được tổng hợp trong bảng 3.24.
Bảng 3.24. Thông số kỹ thuật cho nhân sinh khối các chủng vi sinh vật
Thông số kỹ thật Chủng RA18
Chủng P1107
Chủng S3.1
Chủng PT5.1
Môi trường lên men YGB SX2 SX5 SX3
pH 7,0 7,0 7,0 6,5
Nhiệt độ lên men (oC) 30 30 30 30
Tỷ lệ giống cấp I (%) 5 5 5 3
Lưu lượng cấp không khí
(lít KK/lít MT/phút) 0,65 0,70 0,70 0,65
Tốc độ cánh khuấy
(vòng/phút) 300 350 350 300
Thời gian lên men (giờ) 72 36 36 36
Các chủng vi sinh vật sau quá trình nhân sinh khối được đánh giá lại hoạt tính sinh học. Kết quả được trình bày trong bảng 3.25.
Bảng 3.25. Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật Tên, kí hiệu
chủng VSV
Hoạt tính
sinh học Giống gốc Sau
lên men Bradyrhizobium
japonicum RA18
Khả năng cố định nitơ (hàm lượng etylen hình thành, nmolC2H4/cây)
3.458 ± 10,95 3.441 ± 12,58
Bacillus megaterium P1107
Khả năng phân giải phốt phát khó tan (đường kính vòng phân giải Ca3(PO4)2, mm)
18,0 ± 0,35 17,83 ± 0,29
Paenibacillus castaneae S3.1
Khả năng hòa tan kali (đường kính vòng phân giải fenspat, mm)
12,0 ± 0,35 11,87 ± 0,23
Lipomyces starkeyi PT5.1
Khả năng sinh chất giữ ẩm polysacarit (độ nhớt N.s/m2)
(37,6 ± 0,42) x10-3
(37,0 ± 0,5) x10-3
Kết quả ở bảng 3.25 cho thấy: Sau nhân sinh khối bốn chủng vi sinh vật nghiên cứu, hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu không có sự thay đổi đáng kể so với giống gốc. Kết quả trên cho thấy các thông số kỹ thuật lựa chọn phù hợp cho quá trình nhân sinh khối các chủng vi sinh vật.