2.8.1. ADN tái bản theo nguyên tắc bảo toàn một nửa
Năm 1957 J. Stent và M. Debruck đã đưa ra ba kiểu tái sinh của ADN có thể có, đó là:
Kiểu bảo toàn: Chuỗi xoắn kép mới được hình thành hoàn toàn từ nguồn nguyên liệu mới, còn chuỗi xoắn kép ban đầu vẫn được giữ nguyên.
Kiểu bảo toàn một nửa: Mỗi chuỗi xoắn kép mới gồm một mạch đơn nguyên vẹn của chuỗi xoắn kép ban đầu và một mạch đơn được hình thành hoàn toàn từ nguồn nguyên liệu mới.
Kiểu phân tán: Các sợi đơn của chuỗi xoắn kép ban đầu được đứt ra thành từng đoạn nhỏ, mỗi đoạn nhỏ làm khuôn để tổng hợp nên một đoạn nhỏ mới. Sau đó các đoạn nhỏ nối với nhau thành sợi đơn. Các sợi đơn liên kết với nhau thành hai chuỗi xoắn kép.
Hình 2.9. Các giả thuyết về nguyên tắc sao chép ADN
Tái bản theo kiểu bảo toàn một nửa đã được M. Meselson và F. Stahl chứng minh ở vi khuẩn E. Coli bằng cách sử dụng đồng vị phóng xạ nitơ nặng (15N). ADN chứa 15N (nặng) được phân biệt với ADN bình thường chứa 14N (nhẹ) bằng cách cho ly tâm trong gradient nồng độ của CsCl với sự xuất hiện hai vạch trong hai ống nghiệm có độ chênh lệch khá xa nhau (vạch nặng và vạch nhẹ).
Đầu tiên nuôi vi khuẩn E.coli trong môi trường chỉ chứa 15N qua nhiều thế hệ để thu nhận các tế bào vi khuẩn có toàn bộ ADN chỉ chứa 15N. Sau đó nuôi cấy E.coli nói trên ở môi trường chỉ chứa 14N qua một số thế hệ, sau mỗi thế hệ đều tách ADN và ly tâm sản phẩm tách. Kết quả thu được:
Sau thế hệ thứ nhất: Trong ống nghiệm chỉ thấy một vạch trung bình.
Sau thế hệ thứ hai: Trong ống nghiệm thấy một vạch trung bình và một vạch nhẹ.
Sau thế hệ thứ ba: Trong ống nghiệm vẫn thấy một vạch trung bình và một vạch nhẹ.
Kết quả thí nghiệm chứng tỏ sản phẩm ở vạch trung bình của các thế hệ đều là chuỗi xoắn kép gồm một sợi đơn chỉ chứa 15N và một sợi đơn chỉ chứa 14N, đồng nghĩa với việc ADN đã tái bản theo kiểu bảo toàn một nửa.
Để có cơ sở khẳng định chắc chắn, người ta đã làm biến tính các chuỗi xoắn kép ở vạch trung bình để chúng tách đôi thành các sợi đơn. Cho ly tâm sản phẩm tách thấy trong ống nghiệm xuất hiện hai vạch tách biệt nhau khá xa, chứng tỏ một vạch có
các sợi đơn chỉ chứa 15N (sợi được bảo toàn nguyên vẹn từ thế hệ thứ nhất), còn vạch kia có các sợi đơn chỉ chứa 14N (sợi được hình thành mới hoàn toàn ở các thế hệ sau).
2.8.2. Cơ chế tái bản của ADN ở sinh vật nhân sơ
ADN của sinh vật nhân sơ (điển hình là E.coli ) có dạng vòng và sự tái bản được xuất phát từ một điểm khởi đầu (replication origin, gọi tắt là điểm ori), tiến theo hai chiều ngược nhau trên phân tử dạng vòng. Quá trình tái bản diễn ra như sau:
Sự tháo xoắn chuỗi kép để hình thành các sợi đơn làm khuôn
Đầu tiên có một protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi đầu tái bản (mang một trình tự nucleotit đặc biệt) và gắn vào đó. Sau đó enzym topoisomerase (ở E.coli gọi là gyrase) gây khía đứt một trong hai sợi đơn của chuỗi xoắn kép làm cho nó tháo xoắn ở hai phía của protein B, khe đứt được nối lại nhanh chóng nên cấu trúc của ADN vẫn được bảo toàn nguyên vẹn. Theo sau hai phân tử gyrase di chuyển ngược chiều nhau so với điểm ori là hai phân tử enzym helicase có chức năng gây đứt các liên kết hydro nối giữa hai sợi đơn để tách đoạn kép đã tháo xoắn ra làm đôi. Hai đoạn sợi đơn tách nhau dần để hình thành hai chạc ba tái bản (ở hai phía của điểm ori) di chuyển ngược chiều nhau làm cho chiều dài hai đoạn sợi đơn tăng dần. Các phân tử protein làm căng mạch SSB (single - strand binding protein) bám vào mỗi sợi đơn làm cho chúng thẳng ra, không thể chập trở lại với nhau.
Sự hình thành các sợi đơn mới
Được xảy ra đồng thời ở hai chạc ba tái bản. Nguyên liệu để tạo các sợi đơn mới là các nucleotit triphotphat (ATP, GTP, CTP và TTP). Phản ứng trùng hợp được diễn ra với sự tham gia của ADN polymerase III có chức năng xúc tác các nucleotit tự do đính với các nucleotit bổ sung trên sợi khuôn, nhờ đó mà sợi đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’ → 3’. Tại mỗi chạc ba tái bản:
Ở sợi khuôn tách mạch theo hướng 3’-5’, ADN polymerase III gắn vào đầu sợi để xúc tác tổng hợp sợi đơn mới hướng vào chạc ba. Chạc ba di chuyển tới đâu sợi đơn này được hình thành theo sau tới đó, nên luôn được hình thành trước sợi còn lại, do đó được gọi là sợi đi trước.
Còn ở sợi khuôn tách mạch theo hướng 5’-3’, việc tổng hợp sợi mới diễn ra phức tạp hơn. Khi chạc ba cách đầu sợi khuôn một khoảng 1000 ÷ 2000 nucleotit, enzym primase gắn mồi ARN (gồm khoảng 10 ribonucleotit) vào vị trí có các nucleotit bổ sung trên sợi khuôn. ADN polymerase III gắn vào mồi để xúc tác các nucleotit tự do đính với các nucleotit bổ sung trên sợi khuôn để tổng hợp đoạn sợi mới có chiều 5’
→ 3’. Đồng thời với quá trình tổng hợp đoạn sợi đơn thứ nhất, chạc ba tái bản tiếp tục di chuyển do hoạt động xúc tác của helicase cho tới khi nó cách mồi ARN thứ nhất một khoảng 1000 ÷ 2000 nucleotit thì lại có mồi ARN thứ hai được gắn vào sợi khuôn
và đoạn sợi đơn thứ hai được tổng hợp theo đúng như cơ chế tổng hợp đoạn sợi đơn thứ nhất. Cứ như thế, các đoạn sợi đơn tiếp theo (có độ dài 1000 ÷ 2000 nucleotit, được gọi là các đoạn Okazaki) tiếp tục được tổng hợp. Nhờ hoạt tính exonuclease 5’
→ 3’, enzym ADN polymerase I cắt bỏ mồi ARN, đồng thời xúc tác lắp ráp các nucleotit tự do (bổ sung với các nucleotit trên sợi khuôn) vào chỗ trống làm cho các đoạn Okazaki thứ 2, thứ 3,... được nối dài thêm theo hướng 5’ → 3’. Sau đó các đoạn Okazaki được nối với nhau nhờ sự xúc tác của enzym ligase. Sợi mới được tổng hợp này luôn được hình thành chậm hơn, nên được gọi là sợi theo sau.
Hình 2.10. Cơ chế tái bản của ADN
Quá trình cứ thế diễn ra cho tới khi hai chạc ba gặp nhau thì phân tử ADN ban đầu được tách thành hai phân tử ADN con giống nhau và giống hệt phân tử ADN ban đầu. Phân tử ADN của vi khuẩn E.coli chứa khoảng 4.106 cặp nucleotit, ở điều kiện 37oC sẽ kết thúc tái bản sau khoảng 20 phút. Do sự tái bản chỉ được xuất phát từ một điểm nên tốc độ tái bản của ADN E.coli sẽ là: 4.106 /20 = 2.105 (cặp nucleotit/phút), tương ứng 3000 cặp nucleotit/giây.
2.8.3. Cơ chế tái bản của ADN ở sinh vật nhân chuẩn
Quá trình chung của sự tái bản ADN ở sinh vật nhân chuẩn giống với ở sinh vật nhân sơ. Tuy nhiên sự tái bản ở sinh vật nhân chuẩn phức tạp hơn và có một số điểm khác biệt:
+ ADN của sinh vật nhân chuẩn là những sợi rất dài, sự khởi đầu tái bản được xảy ra đồng thời từ nhiều vị trí xuất phát trên cùng một phân tử ADN. Tại mỗi vị trí xuất
phát, sự tái bản cũng được diễn ra theo hai chiều ngược nhau cho tới khi các chạc ba tái bản di chuyển từ hai vị trí xuất phát lân cận gặp nhau.
+ Tốc độ tái bản chậm, với khoảng 100-300 cặp nucleotit/giây. Các phân tử ADN trên các nhiễm sắc thể khác nhau có thể tái bản không đồng thời, do đó phải mất 1 ÷ 2 giờ mới hoàn tất quá trình tái bản.
+ Có ba loại ADN polyomerase tham gia xúc tác quá trình tái bản, đó là: , và . Trong đó, hai loại và có mặt trong nhân, còn loại lại có mặt ở các bào quan (ty thể). Đã xác định được vai trò của các loại ADN polymerase này: đối với các sinh vật nhân chuẩn bậc cao nói chung thì polymerase được tế bào sử dụng để xúc tác quá trình tái bản ADN của nhân, polymerase có thể hoạt động như một enzym sửa chữa, còn polymerase thì chuyên trách xúc tác quá trình tái bản ADN ty thể. Ngoài ra còn có các yếu tố tham gia vào quá trình tái bản khác, như: RFA, RFB, RFC, ... Chúng liên hợp với ADN để hỗ trợ cho quá trình tái bản (chức năng chưa được sáng tỏ).
2.8.4. Tái bản theo kiểu vòng xoay
Là kiểu tái bản của phân tử ADN dạng vòng mà một số virus dùng để nhân bản gen và một số vi khuẩn sử dụng để chuyển ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận trong quá trình trao đổi vật chất di truyền. Trong kiểu tái bản này, một trong hai sợi của phân tử ADN ban đầu vẫn giữ nguyên cấu trúc và tự xoay trong quá trình diễn ra tái bản.
Endonuclease nhận biết và cắt sợi kia tại một điểm ở vị trí khởi đầu, từ điểm cắt này tạo ra hai đầu mở là 5’P và 3’OH. Khi sợi nguyên xoay theo chiều 3’ → 5’ thì đầu mở 5’P của sợi bị cắt sẽ được tách khỏi mạch nguyên và vươn dài dần. Quá trình tái bản được bắt đầu bằng sự lắp ráp liên tục các nucleotit tự do (bổ sung với các nucleotit trên sợi nguyên) vào đầu mở 3’OH. Đồng thời, sự lắp ráp các nucleotit tự do (bổ sung với các nucleotit trên sợi được tách ra) cũng được diễn ra, song không liên tục, mà với những đoạn nhỏ theo chiều 5’ → 3’ hướng ra đầu mở 5’P của sợi được tách ra. Sau đó các đoạn này được nối lại với nhau. Khi sợi nguyên kết thúc một vòng xoay thì có hai phân tử ADN dạng vòng mới được hình thành, trong đó phân tử tái bản trên khuôn của sợi được tách ra được hình thành bằng cách tự đóng vòng.
Hình 2.11. Cơ chế tái bản của ADN theo kiểu vòng xoay
Tái bản theo kiểu vòng xoay còn có thể quan sát thấy ở một số trường hợp
tách ra rồi tự đóng vòng, vòng này tái bản theo kiểu vòng xoay để tạo ra nhiều bản sao mới.
2.8.5. Ý nghĩa của tái bản ADN
Tái bản chính xác của ADN trước khi tế bào thực hiện sinh sản (phân bào nguyên nhiễm) và cơ thể thực hiện sinh sản (phân bào giảm nhiễm) là cơ sở phân tử cho quá trình truyền đạt nguyên vẹn vật chất di truyền qua các thế hệ.
Tái bản chính xác của ADN trước khi tế bào thực hiện phân bào nguyên nhiễm là cơ sở cho hệ gen đặc trưng của cơ thể được nhân rộng nguyên vẹn ra nhiều tế bào khác nhau, tạo điều kiện cho các gen khác nhau của cùng một hệ gen được biểu hiện ở các loại tế bào khác nhau, là cơ sở của sự hình thành các loại tế bào khác nhau để tạo nên các mô khác nhau ở cùng một cơ thể.
Quá trình tái bản của ADN trong tế bào sống là một trong các cơ sở quan trọng của phản ứng nhân gen in vitro (PCR) - một kỹ thuật sinh học phân tử có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các hoạt động khoa học công nghệ và thực tiễn.