1.2. TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT
1.2.2. Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã)
Sự biểu hiện của gen đích thường được điều hòa ở nhiều mức độ khác nhau trong đó những gen có hoạt động phiên mã cao thường dẫn đến hàm lượng protein tạo ra cao hơn. Điều hòa sự phiên mã là bước điều hòa sớm trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp. Do vậy, các nỗ lực hiện nay của các nhà nghiên cứu đều tập trung vào bước này để nhằm tăng mức độ phiên mã.
Để sự phiên mã diễn ra ở mức độ cao, cần sự biểu hiện mạnh của yếu tố điều hòa “promoter”. Promoter gồm một trình tự nucleotide phía đầu 5‟ của điểm khởi đầu phiên mã gen cấu trúc, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen.
Promoter có chứa các trình tự cần thiết cho RNA polymerase bám vào để bắt đầu quá trình phiên mã và điều khiển sự phiên mã. Việc hiểu biết về thành phần của promoter và các yếu tố liên quan tới hoạt động của nó sẽ mở ra triển vọng điều khiển sự biểu hiện gen ở mức phiên mã. Promoter có thể đƣợc phân loại thành một số nhóm dựa trên hoạt động của chúng.
Promoter cấu trúc
Các promoter điều khiển sự biểu hiện của gen không chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường hay yếu tố phát triển được gọi là promoter cấu trúc (constitutive promoter). Promoter cấu trúc thường được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp ở tất cả các mô của thực vật. Trong số các promoter cấu trúc, promoter CaMV35S (viết tắt 35S) đƣợc sử dụng rộng rãi để biểu hiện ở mức độ cao các protein tái tổ hợp (Gutierrez-Ortega et al., 2005). Hoạt động của promoter 35S ở cây hai lá mầm hiệu quả hơn so với cây một lá mầm có thể là do sự khác nhau về chất lƣợng hoặc số lƣợng của các yếu tố điều hòa.
Promoter 35S cũng đƣợc sử dụng để sản xuất một số protein kháng nguyên trong thực vật nhƣ CTB (cholera toxin B subunit), LTB (heat-labile enterotoxin B subunit), HbsAg (hepatitis B surface antigen), kháng nguyên bảo vệ, glycoprotein G của virus gây bệnh dại, glycoprotein của virus gây bệnh SARS (Li et al., 2006b) và một số sản phẩm khác có tác dụng chữa bệnh hoặc đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp nhƣ kháng thể đơn dòng, tơ nhện, peptide SMAP-29, streptavidin, avidin và adiponectin (Berberich et al., 2005).
Promoter Ubiquitin là một promoter cấu trúc cũng đƣợc sử dụng phổ biến.
Promoter này đƣợc phân lập từ nhiều loại cây trồng khác nhau nhƣ ngô, Arabidopsis, khoai tây, cây hướng dương, cây thuốc lá, cây lúa (Wang, Oard 2003).
Stoger et al đã chuyển nạp thành công gen scFvT84.66 vào cây lúa với promoter ubiquitin phân lập từ cây ngô và promoter 35S đã cải biến. Kết quả cho thấy kháng thể tái tổ hợp đƣợc biểu hiện ở mô lá và hạt khi sử dụng promoter ubiquitin trong khi các dòng đƣợc chuyển cấu trúc mang promoter 35S chỉ biểu hiện ở mô lá, không có ở hạt (Stoger et al., 2000). Một số phân tử nhƣ CTB, LTB, HbsAg, interferon người, avidin và aprotonin cũng đã được biểu hiện thành công ở thực vật khi sử dụng promoter ubiquitin (Kang et al., 2006). Gần đây, Hernandez-Garcia et al (2009) đã thông báo đặc tính của promoter polyubiquitin đƣợc phân lập từ cây đậu tương, đây là một promoter cấu trúc hoạt động mạnh hơn so với các promoter cấu trúc khác (Hernandez-Garcia et al., 2009).
Ngoài hai loại promoter cấu trúc đƣợc sử dụng phổ biến ở trên, các nghiên cứu cũng sử dụng promoter cấu trúc khác nhƣ promoter anopine synthase, promoter cryptic từ cây thuốc lá, promoter Mac là một promoter lai giữa promoter mannopine synthase và promoter 35S có trình từ tăng cường, promoter actin từ lúa, promoter actin của cây chuối, promoter C1 của virus gây bệnh xoăn lá cây bông và promoter nopaline synthase để sản xuất các phân tử sinh học trong thực vật (Sharma, Sharma 2009).
Promoter đặc hiệu ở mô
Promoter điều khiển sự biểu hiện của gen ở trong một loại mô hoặc ở một giai đoạn phát triển nhất định của thực vật đƣợc gọi là promoter đặc hiệu mô. Các gen được chuyển dưới sự điều khiển của promoter này sẽ chỉ biểu hiện ở mô đặc hiệu, không biểu hiện ở các mô còn lại của cây. Các promoter này giúp tập trung các sản phẩm chuyển gen ở những cơ quan đích nhƣ hạt, quả… mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng của các mô, cơ quan còn lại của cây. Đến nay, đã có một số promoter đặc hiệu đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng cho mục đích biểu hiện các phân tử sinh học ở các cơ quan đặc hiệu của thực vật. Promoter patatin đặc hiệu ở củ đƣợc phân lập từ khoai tây đã đƣợc sử dụng để biểu hiện CTB, LTB, HbsAg, dextran và dạng đột biến của enzym sucrase trong củ khoai tây (He et al., 2007).
Quả đƣợc cho là cơ quan đích thích hợp cho biểu hiện đặc hiệu các kháng nguyên vaccine vì quả có thể sử dụng trực tiếp mà không cần chế biến. Promoter E8 là promoter đặc hiệu ở quả đƣợc phân lập từ cây cà chua đã đƣợc sử dụng để biểu hiện nhiều kháng nguyên khác nhau trong quả (Jiang et al., 2007). Một số promoter đặc hiệu đã đƣợc phân lập để biểu hiện các phân tử sinh học trong một số mô cơ quan đặc hiệu nhƣ ở hạt gồm promoter arcelin, promoter globulin-1, promoter zein từ cây ngô, promoter globulin 7S, promoter glutelin từ lúa và promoter của tiểu phần P- conglycinin a‟ từ đậu tương (Sharma, Sharma 2009). Các promoter đặc hiệu ở hạt đã đƣợc sử dụng để biểu hiện pro-insulin, laccase, epitope của tế bào lympho T của người, provitamin A và phytase (Aluru et al., 2008). Promoter arcelin được các nghiên cứu khẳng định là điều khiển mạnh hoạt động của gen ngoại lai ở mức độ
phiên mã trong thực vật. Promoter arcelin 5-1 từ cây đậu cũng đã đƣợc sử dụng để biểu hiện scFv với hàm lƣợng chiếm 36% protein tan tổng số.
Promoter đặc hiệu ở lục lạp cũng đƣợc sử dụng để biểu hiện các protein tái tổ hợp trong bào quan này. Promoter RNA ribosom 16S (Prrn) hoặc promoter của gen psbA là hai promoter đặc hiệu ở lục lạp đƣợc sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên bảo vệ, CTB, LTB và insulin (Ruhlman et al., 2007).
Promoter của gen rbcs đặc hiệu ở lá đƣợc sử dụng để biểu hiện tiểu phần vaccine đậu mùa, endoglucanase E1 và xylanase (Golovkin et al., 2007). Gần đây, Wakasa et al (2009) đã thông báo về hệ thống biểu hiện đặc hiệu ở callus để sản xuất các protein tái tổ hợp ở thực vật (Wakasa et al., 2009).
Promoter cảm ứng
Promoter cảm ứng là các promoter hoạt động dưới sự điều khiển của các hóa chất nhƣ cồn, tetracyline, steroid… hoặc bởi các yếu tố vật lý nhƣ hạn hán, mặn, nhiệt độ, ánh sáng… Sự biểu hiện liên tục của các phân tử ngoại lai bao gồm cả protein dưới sự điều khiển của promoter cấu trúc trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của thực vật, thậm chí làm cho thực vật không thể tái sinh đƣợc. Để vƣợt qua đƣợc khó khăn này có thể sử dụng promoter biểu hiện đặc hiệu ở mô hoặc promoter cảm ứng bởi các hóa chất để điều khiển sự biểu hiện của gen chuyển trong thực vật. Các promoter này “nghỉ” khi vắng mặt các yếu tố cảm ứng. Việc sử dụng các promoter cảm ứng bởi hóa chất kết hợp với các yếu tố phiên mã đáp ứng với hóa chất có thể giới hạn sự biểu hiện của gen chuyển ở mô, cơ quan đặc hiệu thậm chí là loại tế bào (Zuo, Chua 2000).
Để gen biểu hiện mạnh dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng thì cần yếu tố cảm ứng phải có độ đặc hiệu cao với promoter, không độc với thực vật, thực vật phải đáp ứng nhanh với yếu tố cảm ứng, dễ dàng thực hiện và nếu yếu tố đó là hóa chất thì tốt nhất là thực vật ngoài tự nhiên không chứa hợp chất này. Promoter cảm ứng bởi sự thiếu hụt sucrose của gen alpha amylase (αAmy3) đã đƣợc sử dụng để biểu hiện interferon γ của người (Chen et al., 2004). Promoter của gen αAmy3 cũng
được sử dụng để điều khiển sự biểu hiện của hormon sinh trưởng người ở tế bào huyền phù cây lúa (Kim et al., 2008). Promoter cảm ứng cũng đƣợc sử dụng để sản xuất yếu tố kích thích của bạch cầu hạt (hGM-CSF) ở tế bào lúa đƣợc nuôi cấy huyền phù và kết quả cho thấy hàm lƣợng hGM-CSF cao hơn so với đối chứng đƣợc biểu hiện trong cây thuốc lá sử dụng promoter cấu trúc (Shin et al., 2003).
Ngoài ra còn nhiều promoter cảm ứng bởi tetracycline, ecdysone, estrogen, glucocorticoid, cồn đã đƣợc sử dụng trong thực vật. Về cơ bản, các promoter cảm ứng chứa hai đơn vị phiên mã. Sản phẩm của đơn vị phiên mã thứ nhất là một yếu tố phiên mã, đáp ứng với tín hiệu cảm ứng là hóa chất. Đơn vị phiên mã thứ 2 chứa một yếu tố có vai trò hoạt hóa yếu tố phiên mã. Yếu tố phiên mã đáp ứng với hóa chất có thể đƣợc điều hòa bằng cách sử dụng promoter cấu trúc hoặc promoter đặc hiệu, cung cấp thêm một cơ chế điều hòa bổ sung cho gen chuyển.
Promoter nhân tạo
Là promoter được con người tạo ra thông qua các thao tác kỹ thuật trong sinh học phân tử. Promoter nhân tạo gồm các yếu tố tối thiểu nhƣ hộp TATA cần thiết hoạt động của RNA polymerase II, một điểm khởi đầu phiên mã và một trình tự điều hòa CCAAT giúp cho hoạt động của promoter ở sinh vật nhân chuẩn. Ngoài các yếu tố tối thiểu, các promoter nhân tạo cũng cần có các yếu tố khác để giúp cho promoter này có thể hoạt động điều hòa ngƣợc chiều hoặc xuôi chiều (Novina, Roy 1996). Các promoter nhân tạo được thiết kế trước đây là sự kết hợp giữa các yếu tố cis gồm trình tự tăng cường và trình tự hoạt hóa hoặc ức chế. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng để promoter hoạt động hiệu quả thì phụ thuộc rất nhiều vào số motif nhắc lại và khoảng cách giữa các motif trong promoter (Gurr, Rushton 2005). Để tăng hiệu quả hoạt động của promoter 35S, trình tự tăng cường được lặp lại nhiều lần (Guerineau et al., 1992). Promoter lai mac đƣợc thiết kế bằng cách kết hợp một phần promoter mac với trình tự tăng cường của promoter 35S, hoạt động của promoter này làm tăng sự biểu hiện của GUS từ 3-5 lần ở trong lá và tăng 10-15 lần ở trụ dưới lá mầm và rễ so với đối chứng sử dụng promoter 35S có trình tự tăng cường lặp lại 2 lần (Comai et al., 1990).