3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO
3.3.1. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2
Để tạo dòng tế bào BY2 mang gen chuyển, tiến hành đồng nuôi cấy tế bào BY2 chủng dại (wild type) với vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện khác nhau (gồm pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter và pBI121/35S-pro/Mir/NOS), huyền phù tế bào BY2 được cấy trải nhẹ trên môi trường có tác nhân chọn lọc kanamycin 100 mg/l.
Kết quả tạo và chọn lọc các dòng tế bào BY2 mang gen tái tổ hợp đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.13. Cụ thể, sau khoảng 4 tuần, thu đƣợc các dòng (cụm callus) BY2 ban đầu trên (hình 3.13B), cụ thể số dòng BY2 đƣợc chuyển cấu trúc HSP-pro/Mir/HSP-ter và 35S-pro/Mir/NOS-ter lần lƣợt là 68 và 70. Tiếp tục chọn lọc trên môi trường đặc và lỏng nhằm thu được các dòng BY2 ổn định và đồng nhất, sau khoảng 3-4 lần cấy chuyển với khoảng cách giữa mỗi lần là 1 tuần, số dòng BY2 đƣợc chuyển cấu trúc HSP-pro/Mir/HSP-ter và 35S-pro/Mir/NOS-ter ổn định lần lƣợt là 12 và 14 (hình 3.13E, F).
Bảng 3.3. Kết quả tạo và chọn lọc các dòng tế bào BY2 mang gen chuyển miraculin
Cấu trúc Số dòng BY2 ban đầu Số dòng BY2 ổn định
HSP-pro/Mir/HSP-ter 68 12
35S-pro/Mir/NOS-ter 70 14
Hình 3.13. Quá trình tạo dòng tế bào thuốc lá BY2 mang gen miraculin
(A). Đồng nuôi cấy giữa vi khuẩn A. tumefaciens với tế bào BY2 chủng dại; (B). Dòng (callus) BY2 ban đầu trên môi trường chọn lọc; (C). Ảnh hiển vi soi nổi callus trên môi trường chọn lọc: C1-callus hóa nâu-chết, C2-callus màu trắng sáng-sống sót; (D). Dòng tế
bào BY2 sau 1 lần chọn lọc; (E). Dòng BY2 chuyển gen sau 3-4 lần chọn lọc; (F). Tái huyền phù dòng BY2 trong môi trường lỏng chứa tác nhân chọn lọc.
Quá trình chọn lọc các dòng BY2 chuyển gen miraculin đƣợc thực hiện tương đối dễ dàng do trong cấu trúc T-DNA được chuyển vào tế bào BY2 có chứa gen đích miraculin và gen nptII mã hóa cho enzym phân hủy kanamycin, do đó gen nptII cũng đƣợc tích hợp vào hệ gen của tế bào chủ nên chỉ những tế bào đƣợc chuyển gen mới có thể sống sót trên môi trường chứa kháng sinh kanamycin, quan sát bằng mắt thường có thể thấy các tế bào BY2 không mang gen thường tạo callus hóa nâu, còn các tế bào BY2 mang gen nptII (có thể chứa gen miraculin) tạo cụm callus màu sáng (hình 3.13C, E). Những dòng BY2 sinh trưởng ổn định được chọn để tiến hành đánh giá sự có mặt của gen miraculin bằng kỹ thuật PCR.
3.3.1.2. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng BY2 bằng kỹ thuật PCR
Để đánh giá sự có mặt của gen miraculin nhân tạo trong các dòng tế bào BY2, chọn ngẫu nhiên 3 dòng với mỗi cấu trúc từ các dòng BY2 ổn định để tiến hành tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Mir_opt_F/R. Kết quả điện di sản phẩm đƣợc thể hiện ở hình 3.14.
Hình 3.14. Hình ảnh điện di kiểm tra một số dòng BY2 đƣợc chuyển gen miraculin bằng kỹ thuật PCR trên gel agarose 0,8% (w/v). (+), (-). Đối chứng dương và đối chứng âm;
đường chạy 1, 2, 3-phía bên trái M: các dòng BY2 được chuyển cấu trúc HSP- pro/Mir/HSP-ter; đường chạy 1, 2, 3-phía bên phải M: các dòng BY2 được chuyển cấu trúc
35S-pro/Mir/NOS-ter; (M). Thang DNA chuẩn DNA chuẩn 1 kb.
Phân tích kết quả hình 3.14 cho thấy tất cả các đường chạy điện di đều xuất hiện một băng đặc hiệu kích thước khoảng 700 bp, kích thước này tương ứng với kích thước gen miraculin được thiết kế. Kết quả này khẳng định, đã tạo thành công dòng tế bào BY2 mang cấu trúc HSP-pro/Mir/HSP-ter và 35S-pro/Mir/NOS-ter, các dòng tế bào này (B.HSP11, B.HSP2, B.HSP3, B.35S1, B.35S2 và B.35S3) đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để đánh giá sự biểu hiện của protein miraculin tái tổ hợp bằng kỹ thuật lai miễn dịch.
3.3.1.3. Đánh giá sinh trưởng của một số dòng tế bào BY2 chuyển gen
Từ các dòng BY2 đƣợc chuyển gen miraculin, lựa chọn hai dòng BY2 đƣợc chuyển cấu trúc HSP-pro/Mir/HSP-ter (B.HSP1 và B.HSP2), một dòng BY2 đƣợc
- + 1 2 3 M 1 2 3
bp bp
700 500 1.000 3.000
chuyển cấu trúc 35S-pro/Mir/NOS-ter (B.35S1), dòng BY2 không chuyển gen (B.WT) được chọn làm đối chứng được quan sát có sinh trưởng tốt nhất để đánh giá sinh trưởng thông qua sự tích lũy khối tươi và khối lượng khô. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào BY2 chuyển gen
Ngày sinh trưởng Tên dòng
2 ngày ̅ )
4 ngày ̅ )
6 ngày ̅ )
8 ngày ̅ )
10 ngày ̅ )
Khối lượng tươi(g/ml)
B.WT 0,03±0,002a 0,09±0,006ab 0,23±0,010b 0,29±0,010a 0,25±0,006a B.HSP1 0,04±0,002c 0,10±0,010c 0,27±0,006c 0,31±0,010ab 0,30±0,015b B.HSP2 0,03±0,001a 0,09± 0,001bc 0,17±0,010a 0,29±0,010a 0,24± 0,010a B.35S1 0,03±0,002ab 0,08±0,006a 0,26±0,010c 0,32±0,015b 0,28±0,010b
LSD0,05 0,003 0,012 0,017 0,021 0,020
Khối lƣợng khô(g/ml)
B.WT 0,012±0,002a 0,054±0,004bc 0,137±0,012b 0,157±0,015a 0,130±0,010a B.HSP1 0,014±0,003a 0,050±0,002b 0,110±0,010ab 0,143±0,006a 0,120±0,010a B.HSP2 0,012±0,002a 0,044±0,004a 0,096±0,006a 0,160±0,010a 0,120±0,010a B.35S1 0,010±0,001a 0,058±0,002c 0,120±0,010b 0,163±0,012a 0,150±0,010b
LSD0,05 0,003 0,005 0,017 0,021 0,018
Trong cùng một cột, kí tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác với α=0,05
Phân tích bảng 3.4 cho thấy, các dòng BY2 chuyển gen miraculin có khối lượng tươi và khối lượng khô đạt cực đại sau 8 ngày nuôi cấy, khối lượng tươi cao nhất ở dòng B.35S1 (0,32 g/ml), thấp nhất là dòng B.WT (0,29 mg/ml), trong khi đó khối lƣợng khô không có sự khác biệt rõ rệt. Sau 10 ngày nuôi cấy, dịch nuôi các tế bào hóa nâu, các tế bào kết lại với nhau thành đám và chết.
3.3.1.4. Phân tích sự biểu hiện của miraculin tái tổ hợp trong các dòng BY2 chuyển gen bằng kỹ thuật Western blot và ELISA
Sự biểu hiện của protein tái tổ hợp là đích đến quan trọng trong quá trình chuyển gen vào thực vật. Để kiểm tra và đánh giá sự biểu hiện của protein miraculin trong tế bào BY2, các dòng tế bào BY2 chuyển gen và một dòng không chuyển gen (đối chứng âm) sau 8 ngày nuôi cấy đƣợc dùng để tách chiết protein tan tổng sốvà tiến hành phản ứng lai miễn dịch Western blot. Kết quả phân tích Western Blot các dòng BY2 đƣợc thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculin trong một số dòng tế bào BY2 chuyển gen; (+), (-). Đối chứng dương và đối chứng âm; (từ trái qua phải): đường
chạy 1, 2, 3: dòng chuyển gen B.HSP1, B.HSP2, B.HSP3; 1, 2, 3: dòng chuyển gen B.35S1, B.35S2, B.35S3; Phản ứng lai sử dụng kháng thể của c-myc.
Phân tích kết quả cho thấy, protein đƣợc tách chiết từ các dòng tế bào B.HSP1, B.HSP2, B.HSP3 và dòng B.35S1 xuất hiện một băng kích thước khoảng 54 kDa, kích thước này tương ứng với kích thước của miraculin dạng dimer như dự tính, trong khi đó B.35S2 và B.35S3 không xuất hiện. Protein miraculin thu đƣợc từ các dòng B.HSP1, B.HSP2, B.HSP3 và dòng B.35S1 có thể có hoạt tính tạo cảm giác ngọt.
Nhằm đánh giá mức độ tích lũy của protein miraculin trong các dòng BY2, miraculin tái tổ hợp đƣợc định lƣợng gián tiếp bằng kỹ thuật ELISA. Kết quả hàm lượng protein miraculin chứa đuôi c-myc được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn của protein protein scFv gắn đuôi c-myc (phụ lục 9).
M + 1 2 3 1 2 3 -
120
50
25 kDa
54
Hình 3.16. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng BY2 chuyển gen Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong các dòng BY2 dao động từ 1,13-3,10 ng/àg protein tan tổng số, trong đú cao nhất là dũng B.HSP1 đạt 3,10 ng/àg protein tan tổng số, thấp nhất là dũng B.HSP3 và B.35S1 đạt lần lƣợt là 1,14 và 1,13 ng/àg protein tan tổng số (hình 3.16).
Nhƣ vậy, các dòng BY2 đƣợc chuyển cấu trúc chứa promoter và terminator HSP 18.2 có hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp cao hơn so với dòng BY2 đƣợc chuyển cấu trúc 35S-pro/Mir/NOS-ter. Tuy nhiên, miraculin tái tổ hợp đƣợc tạo ra còn khá thấp (khoảng 0,11-0,31%) so với protein tổng số, chiếm chƣa đến 1% so với protein tổng số.