Đến nay đã có một số công trình nghiên cứu biểu hiện protein tạo vị ngọt trên cây cà chua gồm thaumatin II (Firsov et al., 2012), monellin (Reddy et al., 2015) và miraculin (Hirai et al., 2011a, Hirai et al., 2011b, Hiwasa-Tanase et al., 2011, Kurokawa et al., 2013, Yano et al., 2010).
Quá trình sản xuất miraculin tái tổ hợp ở thực vật đầu tiên sử dụng hộp biểu hiện có promoter là 35S và yếu tố kết thúc là NOS terminator. Theo Sun et al (2006a), miraculin tái tổ hợp đƣợc biểu hiện ở cây rau xà lách (Lactuca sativa), miraculin được tạo ra là khoảng 43,5 àg/g khối lượng tươi và miraculin cú đầy đủ hoạt tính tạo cảm giác ngọt với độ ngọt tương đương với miraculin tự nhiên (Sun et al., 2006a). Tuy nhiên, sự “câm lặng” của gen chuyển xảy ra ở các dòng chuyển gen thế hệ con cháu (Sun et al., 2007). Ở cây dâu tây chuyển gen miraculin, loại cây có ƣu thế là sinh sản vô tính, miraculin tái tổ hợp đƣợc tích lũy có hàm lƣợng rất thấp, chỉ khoảng 2,0 àg/g khối lượng tươi, mặc dự mức độ tớch lũy ổn định qua cỏc thế hệ qua sinh sản vô tính (Sugaya et al., 2008). Ngƣợc lại, cây cà chua chuyển gen tạo ra miraculin tỏi tổ hợp vào khoảng 90,7 àg/g khối lượng tươi của quả, với hoạt tớnh tạo cảm giác ngọt tương đương với miraculin tự nhiên (Sun et al., 2007). Ngoài ra, mức độ tích lũy và biểu hiện của gen chuyển là ổn định từ thế hệ T1 đến T5 (Yano et al., 2010).
Thay đổi mã di truyền của gen miraculin từ cây thần kỳ cho phù hợp với cây cà chua cũng giúp tăng cường hiệu quả dịch mã lên gấp 2 lần so với sử dụng gen miraculin tự nhiên ở đối tƣợng cây cà chua chuyển gen (Hiwasa-Tanase et al., 2011). Sự tích lũy của miraculin có mã di truyền đƣợc thay đổi còn đƣợc thể hiện rõ khi sử dụng terminator của gen miraculin tự nhiên so với sử dụng NOS terminator.
Các kết quả này cho thấy thay đổi mã di truyền codon và lựa chọn terminator phù hợp đóng vai trò quan trọng để tăng tích lũy protein tái tổ hợp.
Ở các dòng cà chua chuyển gen miraculin dưới sự điều khiển của promoter 35S cho thấy miraculin tái tổ hợp đƣợc tích lũy nhiều ở quả vào giai đoạn quả chín (Kim et al., 2010a). Trong đó, mức độ tích lũy miraculin trong vỏ quả hoặc biểu bì vào khoảng 928 àg/g khối lượng tươi, ở cỏc mụ khỏc là dưới 110 àg/g. Theo cỏc tỏc giả, sự tích lũy lượng lớn miraculin trong vỏ quả chủ yếu là do kích thước tế bào và kích thước tế bào lại ảnh hưởng đến không gian gian bào (Kim et al., 2010b).
Khi sử dụng promoter 35S để điều hòa hoạt động của gen miraculin ở cây cà chua chuyển gen làm tăng sản lƣợng của miraculin tái tổ hợp (Sun et al., 2007, Yano et al., 2010). Promoter E8 đặc hiệu ở mô thực vật đã đƣợc sử dụng để điều khiển sự biểu hiện của gen miraculin ở cây cà chua chuyển gen (Hirai et al., 2011a).
Sự biểu hiện của gen miraculin và sự tích lũy của protein tái tổ hợp miraculin ở quả cà chua khi sử dụng promoter E8 là thấp hơn so với đối chứng là promoter 35S (Hirai et al., 2011a). Kết quả này khẳng định rằng promoter 35S có hoạt động phiên mã cao hơn so với promoter E8 ở cây cà chua. Khi gen miraculin đƣợc điều khiển bởi promoter 35S và có yếu tố kết thúc là NOS terminator ở cây cà chua chuyển gen, hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp đạt 1,0-1,5% protein tổng số (Hiwasa-Tanase et al., 2011, Kato et al., 2010, Sun et al., 2007). Trong khi đó, hàm lƣợng miraculin ở quả thần kỳ trong tự nhiên dao động khoảng 10% protein tan tổng số (Theerasilp, Kurihara 1988). Do miraculin ở quả thần kỳ ngoài từ nhiên cao hơn so với trường hợp đƣợc nghiên cứu, nên các nhà nghiên cứu đã sử dụng terminator tự nhiên của miraculin vào cây cà chua chuyển gen (Hiwasa-Tanase et al., 2011). Kết quả là mức độ tích lũy của miraculin tái tổ hợp trong các dòng chuyển gen có sử dụng terminator của miraculin tự nhiên đã đƣợc cải thiện, cao hơn 1,5 lần so với khi sử dụng NOS terminator.
Theo tác giả Kim et al (2010a), tạo thế hệ lai F1 từ cây cà chua chuyển gen tích lũy miraculin (cv “Moneymaker”) bằng phép lai giữa các giống cà chua khác
nhau để làm sáng tỏ vai trò của yếu tố di truyền. Mô hình tích lũy trong mô quả không thay đổi, protein đƣợc tích lũy mức độ cao ở vỏ quả, sau đỏ là vỏ giữa đều giống nhau giữa các dòng chuyển gen ban đầu (Kim et al., 2010b). Nhƣng ngƣợc lại, mức độ tích lũy miraculin ở quả thay đổi khi yếu tố di truyền khác nhau, do liên quan đến tỉ lệ giữa mô quả với khối lƣợng quả là khác nhau giữa các giống cà chua.
Ví dụ, tỉ lệ của vỏ quả ở giống “Micro-Tom” là 8,16%, cao hơn khoảng 5% so với các giống khác (Kim et al., 2010a). Mức độ tích lũy của miraculin cũng khác nhau giữa vỏ quả và vỏ giữa giữa các dòng lai (Kim et al., 2010a). Kích thước tế bào và số tế bào trên khối lượng tươi thậm chí là khác nhau trong cùng vỏ quả, phụ thuộc vào dòng lai cũng như kích thước quả. Sự khác nhau về cấu trúc quả cũng được cho là có ảnh hưởng đến mức độ tích lũy cuối cùng của protein tái tổ hợp. Thêm vào đó, sự khác nhau về thời điểm thu hoạch cũng được cho là ảnh hưởng đến sự tích lũy miraculin trong quả trong trường hợp miraculin được điều khiển bởi promoter 35S;
mức độ miraculin trong quả cà chua cao hơn ở thời điểm thu hoạch muộn (Hirai et al., 2011a, Kato et al., 2011). Có thể do sự khác nhau về thời điểm thành thục quả ở các giống khác nhau đã ảnh hưởng đến sự tích lũy của miraculin tái tổ hợp. Việc sử dụng các gen chuyển đồng hợp tử cũng có thể tăng sản lƣợng protein so với gen chuyển dạng dị hợp tử. Trong thực tế, mức độ biểu hiện của gen miraculin trong vỏ quả và vỏ giữa của các dòng đồng hợp tử là 4,7 và 1,5 lần so với các dòng cà chua chuyển gen dạng dị hợp tử, các dòng đồng hợp tử thường có một bản copy của gen miraculin (Kim et al., 2010a). Khi đó, hàm lƣợng của miraculin tái tổ hợp ở các dòng đồng hợp tử này cao gấp 2 lần so với các dòng dị hợp tử. Kết quả nghiên cứu này khẳng định giống cà chua hay bản chất di truyền của giống cà chua đƣợc sử dụng có ảnh hưởng tới sự tích lũy của miraculin tái tổ hợp.
Miraculin đƣợc tiết ra và tích lũy trong lớp gian bào của quả thần kỳ (Hirai et al., 2010b). Theo cách tương tự, miraculin tái tổ hợp cũng có thể được tiết vào khoang gian bào của quả và lá cà chua chuyển gen thông qua việc gắn thêm trình tự tín hiệu vào gen tự nhiên (Hirai et al., 2010b). Hơn nữa, các dòng cà chua chuyển gen miraculin có promoter là 35S và terminator HSP cũng tích lũy miraculin tái tổ
hợp, hàm lượng lờn đến 1,725 àg/g khối lượng tươi, tương đương với 17% tổng protein tan (Hirai et al., 2011b). Mức độ tích lũy này vƣợt qua sản lƣợng tự nhiên của miraculin trong quả cõy thần kỳ (khoảng 400 àg/g khối lượng tươi). Do đú, khoang gian bào là vị trí tốt nhất để tổng hợp miraculin tái tổ hơp ở quả cà chua chuyển gen, mặc dù các khoang nội bào của tế bào lá cũng là thích hợp để tổng hợp miraculin. Sự tích lũy của miraculin tái tổ hợp ở không gian gian bào cũng có ƣu điểm đó là pH của gian bào thường giảm đến 6,7-4,4 trong suốt quá trình chín của quả, pH này là thích hợp cho miraculin có hoạt tính tạo cảm giác ngọt (Almeida, Huber 1999).
Về lý thuyết, hàm lƣợng protein tái tổ hợp có thể tăng khi số bản copy trong cây chủ tăng. Tuy nhiên, tăng số bản copy của gen chuyển bằng cách biến nạp cùng lúc nhiều bản copy không phải luôn đem lại kết quả tốt cho sản lƣợng protein tái tổ hợp bởi vì các thể biến nạp nhiều bản copy thường có mức độ biểu hiện của gen thấp hoặc “gen câm” (Jorgensen et al., 1996).
Trong nghiên cứu này, gen miraculin đã đƣợc thay đổi mã di truyền đã đƣợc chuyển vào cây cà chua với tỷ lệ cao đạt lần lượt 42,11% và 52,38% tương ứng với các dòng cà chua đƣợc chuyển cấu trúc E8-pro/Mir/HSP-ter và 35S-pro/Mir/NOS- ter. Bằng phân tích PCR và Southern blot, bước đầu đã xác định được 27 dòng cây cà chua chuyển gen trong đó 16 dòng đƣợc chuyển cấu trúc E8-pro/Mir/HSP-ter và 11 dòng đƣợc chuyển cấu trúc 35S-pro/Mir/NOS-ter; 5 dòng mang 1 bản copy (T.E8.4, T.E8.7, T.E8.8, T.35S.2, T.35S8). Đối với 11 dòng mang cấu trúc 35S- pro/Mir/NOS-ter, mức độ biểu hiện mRNA của gen miraculin cũng đƣợc xác nhận bằng kỹ thuật RT-PCR. Năm dòng cà chua mang bản đơn copy của gen chuyển đƣợc trồng và chăm sóc trong điều kiện phòng thí nghiệm, các dòng này sinh trưởng bình thường tương tự cây cà chua PT18 không chuyển gen. Sau 80-90 ngày cây ra hoa, hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong vỏ ngoài quả cao nhất ở T.E8.8 (đạt 118,0 ng/àg protein tan tổng số) và gấp khoảng hơn 4 lần so với hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp ở dòng T35S.2 và T35S.8. Bằng phương pháp đánh giá cảm quan, miraculin tái tổ hợp có hoạt tính tạo vị ngọt (trong điều kiện có nước chanh)
tương tự như khi sử dụng quả thần kỳ. Kết quả này mở ra triển vọng sử dụng cây cà chua như “nhà máy” thực vật để sản xuất miraculin ở Việt Nam trong tương lai.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN
1. Mã di truyền của gen miraculin từ cây thần kỳ đƣợc thay đổi phù hợp với hệ biểu hiện ở cây họ cà. Các trình tự promoter E8 từ cây cà chua, promoter và terminator HSP 18.2 từ cây Arabidopsis thaliana đã đƣợc phân lập và tách dòng thành công.
2. Các cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter, pBI121E8- pro/Mir/HSP-ter, pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter đƣợc thiết kế phục vụ chuyển gen vào dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cà chua.
3. Protein miraculin tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong dòng tế bào BY2 với hàm lƣợng từ 1,13-3,10 ng/àg protein tan tổng số; biểu hiện trong hệ thống rễ tơ thuốc lỏ, hàm lƣợng từ 13,7-19,97 ng/àg protein tan tổng số.
4. Biểu hiện thành công miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua (giống PT18 của Việt Nam), gồm 27 dòng cà chua đƣợc chuyển gen trong đó 5 dòng mang bản đơn copy của gen chuyển (T.E8.4, T.E8.7, T.E8.8, T.35S.2, T.35S8). Hàm lƣợng ở vỏ quả của các dòng đƣợc chuyển promoter biểu hiện đặc hiệu ở quả E8 đều cao hơn so với các dòng đƣợc chuyển promoter cấu trỳc 35S. Trong đú cao nhất là dũng T.E8.8 (đạt 118,0 ng/àg protein tan tổng số), gấp hơn 4 lần so với các dòng T.35S.2, T.35S8. Miraculin tái tổ hợp được biểu hiện có hoạt tính tương tự miraculin tự nhiên.
ĐỀ NGHỊ
1. Đánh giá tính an toàn của miraculin tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong các hệ thống BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen. Tạo cơ sở cho khả năng ứng dụng sản xuất miraculin tái tổ hợp trong thực tiễn.
2. Đánh giá sự ổn định của gen chuyển miraculin trong các dòng cà chua qua các thế hệ.
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. La Việt Hồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Chu Hoàng Hà (2013).
Chuyển gen miraculin vào dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kỷ yếu Hội thảo Khoa học Cán bộ trẻ các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ III. 101-105. Nxb ĐH Đà Nẵng.
2. La Việt Hồng, Lê Hoàng Đức, Lê Văn Sơn, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2014). Nhân dòng và phân tích yếu tố tác động cis của promoter E8 từ cà chua (Lycopersicon esculentum L.). Tạp chí sinh học. 36(1):118-124.
3. La Việt Hồng, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2014).
Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum L. Cv Bright Yellow 2). Tạp chí sinh học, 36(3):367- 372.
4. 01 sáng chế (có đơn chấp nhận) Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Phạm Thị Vân, La Việt Hồng: Quy trình tổng hợp, thiết kế, chuyển gen và biểu hiện protein miraculin nhân tạo trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ .
5. La Việt Hồng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2015). Nhân dòng promoter và terminator heat shock protein 18.2 từ Arabidopsis thaliana làm nguyên liệu thiết kế vector biểu hiện gen ở thực vật. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 31, Số 2 28-35.
6. 03 trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng Gen: KJ561284, KM083119 và KP008108.
7. (Dự kiến đăng 2015) La Việt Hồng, Bùi Phương Thảo, Phạm Thị Vân, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà. Tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp miraculin trong cây cà chua.