Để tăng mức độ protein tái tổ hợp ở thực vật cần thay đổi mã di truyền của gen chuyển cho phù hợp với hệ thống thực vật (Daniell et al., 2009). Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự có mặt của các codon hiếm có thể hình thành cấu trúc bậc 2 trong phân tử và làm chậm hoặc tạm dừng sự di chuyển của ribosome qua các vùng đó (Wolin, Walter 1988). Giữa tần suất codon sử dụng với sự có mặt của các tRNA cùng nhóm có sự tương quan chặt chẽ với nhau, do đó sự xuất hiện của một nhóm codon hiếm có thể làm dừng hoạt động của tất cả các tRNA tham gia tổng hợp protein (Chen, Inouye 1990). Bằng việc loại bỏ các trình tự không mong muốn cũng là một cách để tăng cường sự biểu hiện của gen chuyển trong thực vật (Kang et al., 2006). Để sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp một cách hiệu quả, việc lựa chọn hệ thống biểu hiện đóng vai trò rất quan trọng. Trước đây, cây thuốc lá đƣợc xem nhƣ là hệ thống biểu hiện mô hình, bởi vì quá trình biến nạp gen và thao tác thực hiện khá dễ dàng và đây cũng là hệ thống đƣợc lựa chọn để sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp, còn hiện nay, có rất nhiều loài thực vật để sản xuất protein tái tổ hợp nhƣ cây cà chua, cây chuối, lúa, ngô, lúa mỳ, cà rốt, đậu tương, đậu Hà Lan, khoai tây… mỗi loài khác nhau có thể chỉ phù hợp để biểu hiện một vài loại protein tái tổ hợp (Sharma, Sharma 2009). Thông thường, thay đổi mã di truyền thường được thực hiện khi gen chuyển vào hệ thống thực vật có nguồn gốc từ các sinh vật khác nhóm phân loại chẳng hạn nhƣ từ virus, vi khuẩn, động vật…
Trong nghiên cứu này, các hệ thống: tế bào huyền phù thuốc lá BY2, rễ tơ cây thuốc lá, cây cà chuađƣợc lựa chọn để làm hệ thống biểu hiện. Về mặt phân loại, cả ba hệ thống sử dụng đều thuộc họ Cà (Solanaceae), trong đó hệ thống huyền phù BY2 và rễ tơ đều là bắt nguồn từ cây thuốc lá. Các hệ thống này đều cho thấy tiềm năng sản xuất miraculin trong tương lai do có thể có các quá trình điều
hòa sự biểu hiện gen giống nhau. Gen mã cho cho miraculin có chiều dài 663 bp, sau khi đƣợc thay đổi mã di truyền cho phù hợp với hệ thống biểu hiện của cây cà chua bằng các chương trình tin-sinh thì chiều dài gen không đổi, sự tương đồng về nucleotide và acid amin suy diễn của gen trước và sau đổi mã là 74% và 100%.
Trình tự gen sau thay đổi mã di truyền đƣợc bổ sung thêm trình tự signal peptide, trình tự c-myc, trình tự His-tag nhằm phục vụ các phân tích thể chuyển gen sau này.
Ngoài yếu tố loài đƣợc sử dụng để biểu hiện protein quan tâm, các gen tham gia điều khiển hoạt động của gen chuyển cũng đóng vai trò quan trọng nhƣ promoter, terminator... Promoter là yếu tố chủ yếu điều khiển sự biểu hiện của gen đích, xác định loại mô biểu hiện và thời điểm biểu hiện. Có rất nhiều loại promoter khác nhau, thích hợp cho nhiều mục đích của người nghiên cứu, chẳng hạn như promoter cấu trúc, promoter cảm ứng và promoter đặc hiệu. Promoter cấu trúc 35S từ virus khảm súp lơ thường được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp vì mức độ biểu hiện của gen được điều khiển bởi promoter này thường cao hơn so với các promoter đặc hiệu mô thực vật (Desai PN 2010). Tuy nhiên, việc sử dụng promoter cấu trúc này bị mất ưu thế khi protein tái tổ hợp bị ức chế sự sinh trưởng hoặc trao đổi chất của cây chủ ở một số loại mô. Thêm vào đó, rất nhiều trường hợp cho thấy có hiện tƣợng “gen câm” xảy ra thông qua sự đồng ức chế mà có nguyên nhân liên quan đến promoter cấu trúc.
Sự biểu hiện đặc hiệu có nhiều ƣu điểm nhƣ sản phẩm biểu hiện đƣợc tập chung trong quả, hạt, củ, lá… không làm ảnh hưởng tiêu cực tới sinh trưởng của toàn cơ thể thực vật chuyển gen. Quả là cơ quan thường được lựa chọn để biểu hiện kháng nguyên của vaccine và nhiều loại protein tái tổ hợp và sử dụng để biểu hiện rất nhiều kháng nguyên trong quả (Jiang et al., 2007). Việc biểu hiện đặc hiệu miraculin ở quả có ưu điểm là con người có thể sử dụng trực tiếp miraculin quả cà chua, điều này sẽ giúp giảm chi phí thu nhận và tinh sạch miraculin tái tổ hợp ở các hệ thống hoặc vị trí biểu hiện khác.
Sự biểu hiện đặc hiệu ở mô quả cà chua đƣợc điều khiển bởi promoter E8, Promoter E8 biểu hiện đặc hiệu ở quả đã đƣợc phân lập từ cà chua (Deikman et al., 1998). Promoter E8 có nhiều vùng điều khiển (multiple promoter): vùng phản ứng đặc hiệu ở quả phụ thuộc ethylen và vùng điều khiển quá trình chín không phụ thuộc ethylen. Promoter E8 đƣợc phân lập từ giống cà chua PT18 có chiều dài 2191 bp, có độ tương đồng cao (99%) so với các trình tự promoter E8 đã công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế. Dựa trên sự so sánh giữa promoter E8 phân lập đƣợc với các trình tự promoter E8 đã công bố, promoter E8 đƣợc phân lập từ cà chua PT18 có đủ các yếu tố tác động cis đặc trƣng: hộp CAAT, GAGA, TATA, có đầy đủ 2 trình tự: vùng phản ứng với ethylen và vùng biểu hiện đặc hiệu ở quả.
Promoter đƣợc cảm ứng hoạt động bởi các hóa chất nhƣ cồn, tetracycline, steroids... hoặc promoter được cảm ứng bởi các yếu tố vật lý của môi trường như nhiệt độ, sự khô hạn, stress muối, ánh sáng… Promoter biểu hiện thường xuyên (chẳng hạn như 35S) có thể làm ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của thực vật, trong một số trường hợp có thể ngăn cản quá trình tái sinh của cây. Do đó, để vượt qua được trở ngại này, cũng như tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, promter đặc hiệu ở mô hoặc promoter cảm ứng thường được sử dụng.
Promoter HSP 18.2 có chiều dài 720 bp đã đƣợc phân lập thành công, promoter này chứa đầy đủ yếu tố tác động cis đặc trƣng, mang 6 trình tự cảm ứng với nhiệt độ cao, có độ tương đồng 100% với các trình tự đã công bố.
Sử dụng các terminator khác nhau cũng có ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của gen (Ingelbrecht et al., 1989, Nagaya et al., 2010). Yếu tố kết thúc NOS từ plamid Ti của vi khuẩn Agrobacterium đƣợc ứng dụng ở nhiều vector biểu hiện khác nhau khi các gen đƣợc chuyển vào thực vật. Sử dụng terminator HSP 18.2 làm tăng mức độ biểu hiện của miraculin tái tổ hợp cao hơn gấp 10 lần so với NOS terminator (Hirai et al., 2011b). Trong nghiên cứu này, terminator HSP18.2 có kích thước 250 bp, có vị trí poly A site ở nucleotide 158, có độ tương đồng 100% với trình tự đã công bố cũng đã đƣợc thu nhận từ cây Arabidopsis.