3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO
3.3.2. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá
Chuyển gen hai cấu trúc 35S/Mir/NOS và HSP-pro/Mir/HSP-ter vào các mảnh lá thuốc lá thông qua A. rhizogenes ATCC15834. Thí nghiệm đƣợc nhắc lại ba lần thí nghiệm. Với 90 mảnh lá biến nạp của mỗi cấu trúc 35S/Mir/NOS và HSP- pro/Mir/HSP-ter sau 7-10 ngày có lần lƣợt có 31 và 30 số mảnh lá cảm ứng tạo rễ, rễ được hình thành tại các vị trí tổn thương của mảnh lá (hình 3.17A, B). Trung bình số rễ/mảnh cấy sau 7-10 ngày đồng nuôi cấy lần lƣợt là 2,10±1,25 và
3.10a
2.12b
1.14c
1.13c
- 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
B.HSP1 B.HSP2 B.HSP3 B.35S1
Miraculin (ng/àg protein)
Dòng BY2 chuyển gen
1,97±1,38 (hình 3.17A), sau 15 ngày nuôi cấy, số rễ/mảnh cấy tăng lên, đạt lần lƣợt 11,18±1,21 và 10,73±1,19 (hình 3.17B và bảng 3.5).
Bảng 3.5. Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen miraculin
Cấu trúc chuyển
Lô thí nghiệm
Số mẫu biến nạp
Mẫu cảm ứng tạo rễ
Số rễ/mảnh cấy Chọn lọc rễ
Số lƣợng
Tỷ lệ (%)
7 ngày ̅ )
15 ngày ̅ )
Số rễ tách ra
Số rễ sống
sót
Tỷ lệ (%)
35S-pro/Mir/NOS-ter 1 30 10 33,33 2,10±1,10 11,42±1,18 107 107 100
2 30 9 30,00 2,11±1,54 12,04±1,12 90 90 100
3 30 12 40,00 2,08±1,24 10,08±1,34 100 100 100 Tổng
số 90 31 34,44 2,10±1,25 11,18±1,21 297 297 100
HSP-pro/Mir/HSP-ter 1 30 12 40,00 2,33±1,69 10,26±1,16 100 100 100 2 30 10 33,33 1,60±0,97 12,67±1,22 95 95 100
3 30 8 26,67 1,87±1,36 9,26±1,21 70 70 100
Tổng
số 90 30 33,33 1,97±1,38 10,73±1,19 265 265 100
Rễ tơ sau đó được tách và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc mới. Kết quả cho thấy 100% các dòng rễ có thể mang gen miraculin đều sinh trưởng tốt, phân nhánh mạnh trên môi trường chọn lọc (hình 3.17C, D).
Hình 3.17. Quá trình tạo và chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin
(A). Rễ tơ hình thành sau đồng nuôi cấy 7-10 ngày; (B). Rễ tơ đƣợc hình thành sau đồng nuôi cấy 15 ngày; (C). Dòng rễ tơ phân nhánh mạnh trên môi trường chọn lọc; (D). Rễ tơ sinh trưởng nhanh sau 14 ngày cấy chuyển; (E). Rễ tơ trong môi trường lỏng sau 7 ngày và
(F) 28 ngày nuôi cấy.
3.3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong dòng rễ tơ bằng kỹ thuật PCR Chọn ngẫu nhiên 5 dòng rễ tơ từ các dòng đã đƣợc chọn lọc mang cấu trúc HSP-pro/Mir/HSP-ter và 35S-pro/Mir/NOS-ter có sinh trưởng ổn định từ thí nghiệm trên để tiến hành đánh giá sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Mir_opt_F/R. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.18.
Hình 3.18. Hình ảnh điện di kiểm tra một số dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin bằng kỹ thuật PCR trên gel agarose 0,8% (w/v); (+), (-). Đối chứng dương và đối chứng âm; 1, 2, 3, 4, 5-phía bên trái M: rễ tơ đƣợc chuyển cấu trúc HSP-pro/Mir/HSP-ter; 1, 2, 3, 4, 5-
phía bên phải M: rễ tơ đƣợc chuyển cấu trúc 35S-pro/Mir/NOS-ter; (M). Thang DNA chuẩn DNA chuẩn 1 kb.
Phân tích kết quả điện di cho thấy tất cả các dòng rễ tơ đều xuất hiện một băng đặc hiệu tương đương với băng của đối chứng dương, kích thước khoảng 700 bp tương ứng với kích thước gen miraculin được thiết kế. Các dòng này là nguyên liệu quan trọng, dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin.
3.3.2.3. Đánh giá sinh trưởng của một số dòng rễ tơ chuyển gen a. Chỉ tiêu khối lượng tươi và khối lượng khô
Cũng nhƣ hệ thống biểu hiện BY2, rễ tơ là hệ thống tiềm năng để sản xuất protein tái tổ hợp quy mô phòng thí nghiệm. Việc đánh giá khả năng sinh trưởng của rễ tơ trong bình nuôi cấy cho phép bước đầu đánh giá khả năng tích lũy sinh khối của các hệ thống này. Từ các dòng rễ tơ đã đƣợc đánh giá bằng kỹ thuật PCR, lựa chọn 2 dòng rễ tơ mang cấu trúc HSP-pro/Mir/HSP-ter (H.HSP1, H.HSP2) và 1 dòng rễ tơ mang cấu trúc 35S-pro/Mir/NOS-ter (H.35S1) đƣợc nuôi trong môi trường lỏng (hình 3.17E, F) để đánh giá. Kết quả khối lượng tươi và khối lượng khô của các dòng rễ tơ chuyển gen H.HSP1, H.HSP2, H.35S1 và H.WT đƣợc thể hiện ở bảng 3.6.
1 2 3 4 5 M + - 1 2 3 4 5
bp bp
700 500
1.000 3.000
Bảng 3.6. Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng rễ tơ chuyển gen
Ngày sinh trưởng Tên dòng
7 ngày ̅ )
14 ngày ̅ )
21 ngày ̅ )
28 ngày ̅ )
35 ngày ̅ )
42 ngày ̅ )
Khối lượng tươi (g)
H.WT 0,28±0,03a 0,45±0,02a 0,68±0,02ab 0,76±0,03a 0,82±0,02a 0,78±0,03a
H.HSP1 0,31±0,03a 0,55±0,02b 0,77±0,03b 0,86±0,02b 0,87±0,04a 0,78±0,02a
H.HSP3 0,32±0,04a 0,47±0,02c 0,66±0,03a 0,75±0,04a 0,84±0,03a 0,76±0,02a
H.35S1 0,28±0,02a 0,34±0,03d 0,73±0,04b 0,81±0,01ab 0,83±0,03a 0,75±0,02a
LSD0,05 0,052 0,042 0,054 0,082 0,050 0,039
Khối lƣợng khô (g)
H.WT 0,013±0,002a 0,024±0,002a 0,051±0,004a 0,057±0,003a 0,058±0,003a 0,055±0,002a H.HSP1 0,014±0,002a 0,027±0,004a 0,049±0,003a 0,065±0,003c 0,069±0,003c 0,061±0,001b H.HSP3 0,016±0,002a 0,022±0,004a 0,060±0,005b 0,063±0,003bc 0,065±0,003bc 0,061±0,003b H.35S1 0,013±0,004a 0,022±0,004a 0,051±0,003a 0,059±0,001ab 0,063±0,004b 0,059±0,001b
LSD0,05 0,004 0,006 0,006 0,004 0,005 0,003
Trong cùng một cột, kí tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác với α=0,05
Kết quả cho thấy trong môi trường nuôi cấy kín, sinh trưởng của các dòng rễ tơ gồm 4 pha sinh trưởng rõ rệt: pha chuẩn bị (từ 0-7 ngày), pha lũy thừa (từ 7-21 ngày), pha ổn định (từ 28-35 ngày) và pha suy vong (từ 42 ngày trở đi) các dòng rễ tơ sinh trưởng chậm lại, hóa nâu và chết. Sau 35 ngày nuôi cấy, khối lượng tươi của các dòng chuyển gen không có sự khác biệt, đạt từ 0,82-0,87 (g). Tuy nhiên, khối lƣợng khô của các dòng có sự khác nhau, cụ thể dòng H.HSP1 có khối lƣợng khô cao nhất, đạt 0,069 (g), thấp nhất là dòng H.WT, đạt 0,058 (g).
b. Chỉ tiêu chiều dài rễ tơ
Chiều dài của các dòng rễ tơ chuyển gen đƣợc xác định nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng của chúng. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và hình 3.19.
Bảng 3.7. Chỉ tiêu chiều dài của một số dòng rễ tơ chuyển gen (cm)
Ngày sinh trưởng Tên dòng
7 ngày ̅ )
14 ngày ̅ )
21 ngày ̅ ) H.HSP1 2,40±0,10b 5,43±0,25b 7,23±0,25b H.HSP3 2,25±0,25b 4,80±0,40ab 6,90±0,10ab H.35S1 1,76±0,05a 4,53±0,31a 6,60±0,20a
LSD0,05 0,31 0,64 0,38
Trong cùng một cột, kí tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác với α=0,05
Hình 3.19. Hình ảnh chiều dài của một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen. (A). Rễ tơ ban đầu; (B). Sau nuôi cấy 7 ngày; (C). Sau nuôi cấy 14 ngày và (D) 21 ngày
Từ bảng 3.7 cho thấy các dòng rễ tơ chuyển gen kéo dài nhanh, sau 21 ngày nuôi cấy, chiều dài của các dòng rễ tơ đạt 6,60-7,23 (cm), cao nhất là dòng H.HSP1.
Về mặt hình thái, các dòng đều sinh trưởng nhanh, phân nhánh mạnh ở ba dòng H.HSP1, H.HSP3 và H.35S1 thể hiện rõ nhất sau nuôi cấy 14 và 21 ngày (hình 3.19).
3.3.2.4. Phân tích sự biểu hiện của miraculin tái tổ hợp trong các dòng rễ tơ chuyển gen bằng kỹ thuật Western blot và ELISA
Kết quả phân tích sự biểu hiện protein của một số dòng rễ tơ (H.HSP1, H.HSP2, H.HSP3, H.35S1, H.35S2 và H.35S3) bằng Western blot đƣợc thể hiện ở hình 3.20.
Hình 3.20. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculintrong một số dòng rễ tơ;
1, 2, 3-phía bên trái: các dòng rễ tơ H.HSP1, H.HSP2, H.HSP3; 1, 2, 3-phía bên phải: các dòng rễ tơ H.35S1, H.35S2, H.35S3; (+), (-): đối chứng dương và âm. Phản ứng lai sử
dụng kháng thể của protein c-myc.
Phân tích kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.20 chỉ ra miraculin tái tổ hợp không đƣợc tìm thấy trong mẫu rễ tơ không chuyển gen (mẫu đối chứng âm). Ngƣợc lại, các dòng rễ tơ H.HSP1, H.HSP2, H.HSP3 và H.35S1 xuất hiện một băng kích thước khoảng 54 kDa, khối lượng này tương ứng với miraculin dạng dimer. Kết quả này chứng minh gen miraculin đã đƣợc chuyển vào biểu hiện trong rễ tơ thuốc lá.
Lựa chọn 4 dòng rễ tơ có biểu hiện miraculin H.HSP1, H.HSP2, H.HSP3 và H.35S1 để xác định hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp gián tiếp bằng kỹ thuật ELISA.
Kết quả đƣợc chỉ ra ở hình 3.21.
M + 1 2 3 1 2 3 -
54 120
50
25 kDa
Hình 3.21. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng rễ tơ chuyển gen Phân tích cho thấy, mức độ biểu hiện có sự khác nhau rõ rệt giữa các dòng rễ tơ chuyển gen, cụ thể hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp ở các dòng dao động từ 14,13- 19,97 ng/àg protein tan tổng số, trong đú dũng H.HSP2 cú sự biểu hiện miraculin tỏi tổ hợp là cao nhất đạt 19,97 ng/àg protein tan tổng số. Trong khi đú, hàm lƣợng miraculin của các dòng H.HSP1, H.HSP3 và H.35S1 không có sự khác biệt.