Các vector chuyển gen đƣợc thiết kế chứa promoter và terminator (cassette biểu hiện) đã phân lập đƣợc ở mục 3.1.2 gồm: (1) pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter; (2) pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter; (3) pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter; (4) pBI121/HSP- pro/Mir/HSP-ter. Trong đó, vector (2) đƣợc thiết kế làm trung gian để thiết kế vector (3) và (4). Các vector (1), (3) và (4) đƣợc sử dụng để chuyển vào hệ thống biểu hiện.
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter
Dựa vào vector chuyển gen pBI121 để tạo ra vector chuyển gen mang gen miraculin pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter bằng cách thay thế gen GUS bằng gen miraculin theo sơ đồ hình 3.5.
Hình 3.5. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter.
Để thiết kế vector chuyển gen này, tiến hành cắt đồng thời vector tách dòng pBluescript II SK/Mir và pBI121 bằng cặp enzym cắt giới hạn BamHI và SacI để tạo đầu nối sole, sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 3.6A).
BamHI SacI
NOS-ter
RB LB
NOS-ter
NOS-pro NPT II (kanar) 35S Promoter MIR
Hình 3.6. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S- pro/Mir/NOS-ter. (A). Kết quả điện di sản phẩm cắt mở vòng pBI121/35S-pro/Mir/NOS-
ter (đường chạy 1) và pBluescript II SK/Mir (đường chạy 2) bằng cặp enzym BamHI và SacI; (B). Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Mir_opt_R/F (đường chạy 1), (+). Đối chứng dương; (C). Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra vector
pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter bằng enzym cắt giới hạn BamHI và SacI (đường chạy 1);
(M). Thang DNA chuẩn DNA chuẩn 1 kb.
Theo tính toán lý thuyết, từ vector pBI121/35S-pro/GUS/NOS-ter có kích thước 14,7 kb sẽ cắt thành 2 phân đoạn: pBI121/35S-pro/NOS-ter có kích thước 12,9 kb và GUS có kích thước 1,8 kb, còn vector pBluescript II SK/Mir sẽ được cắt thành 2 phân đoạn: pBluescript II SK có kích thước 2,9 kb và miraculin có kích thước 0,76 kb. Kết quả trên hình 3.6A cho thấy ở đường chạy 1, thu được hai băng kích thước lần lượt là 2,9 kb và 0,76 kb, tương ứng với kích thước của phân đoạn pBluescript II SK và gen miraculin theo tính toán lý thuyết, tại đường chạy 2 cũng thu được hai phân đoạn với kích thước lần lượt 12,9 kb và 1,8 kb tương ứng với kích thước lý thuyết của pBI121/35S/NOS và GUS. Từ sản phẩm này, các phân đoạn miraculin và pBI121/35S/NOS đƣợc tinh sạch, chuẩn bị cho phản ứng ghép nối tiếp theo.
2,9 12,9
1,8 0,76
kb kb
M 1 2
10 3
0,75
0,7
kb kb
M + 1
10 3
0,75
12,9
0,76
kb kb
M 1
10 3
0,75
A B C
Sản phẩm ghép nối giữa pBI121/35S-pro/NOS-ter và gen miraculin tạo thành vector tái tổ hợp pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter (13,66 kb) sẽ đƣợc nhân dòng trong E.coli DH5α, sự có mặt của vector này đƣợc xác định bằng phản ứng colony- PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Mir_opt_F/R và bằng phản ứng với enzym cắt giới hạn đối với plasmid thu được từ các khuẩn lạc dương tính, kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.6B và hình 3.6C. Cụ thể, ở đường chạy 1 của hình 3.6B xuất hiện băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,7 kb tương đương với kích lý thuyết của gen miraculin được khuếch đại bởi cặp mồi Mir-opt_F/R, còn ở đường chạy 1 của hình 3.6C xuất hiện hai băng đặc hiệu với kích thước lần lượt 0,76 và 12,9 kb tương đương với kích thước của gen miraculin và vector pBI121/35S-pro/NOS-ter mở vòng. Các kết quả này chứng tỏ vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter đã đƣợc thiết kế thành công. Cấu trúc này sau đó đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A.
tumefaciens CV58 và A. rhizogenes ATCC15834 bằng phương pháp xung điện để phục vụ cho mục đích chuyển gen vào thực vật.
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter
Từ promoter và terminator đã phân lập đƣợc từ cà chua và Arabidopsis, vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter và pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter được thiết kế nhằm tăng cường sự biểu hiện của miraculin tái tổ hợp trong thực vật, hai vector này có chung HSP-ter. Do vậy, vector trung gian pBI121/35S- pro/Mir/HSP-ter đƣợc thiết kế.
Bằng cách sử dụng enzym cắt giới hạn SacI và EcoRI để cắt đồng thời hai vector pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter và pBT/HSP-ter. Các phân đoạn có kích thước quan tâm của sản phẩm cắt đƣợc tinh sạch (thôi gel) gồm vector pBI121/35S- pro/Mir mở vòng có kích thước khoảng ~13,39 kb và terminator HSP 18.2 có kích thước khoảng 0,25 kb. Kết quả điện di trên hình 3.7A cho thấy ở đường chạy 1 và 2 xuất hiện băng có kích thước quan tâm lần lượt là 13,39 và 0,25 kb. Các phân đoạn này đƣợc thu nhận, tinh sạch và điện di kiểm tra, kết quả thể hiện ở hình 3.7B. Kết quả tinh sạch cho thấy các phân đoạn thu đƣợc đảm bảo đủ chất lƣợng cho phản
ứng lai ghép tiếp theo. Sản phẩm ghép nối giữa thực hiện nhờ enzym ligase đƣợc dòng hóa trong vi khuẩn E.coli DH5. Những dòng khuẩn lạc dương tính được xác định bằng phản ứng colony-PCR và phản ứng cắt bằng enzym giới hạn SacI và EcoRI. Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra vector pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter bằng cặp enzym cắt giới hạn SacI và EcoRI đƣợc thể hiện ở hình 3.7C, cụ thể ở đường chạy 1 của hình 3.7C, xuất hiện hai băng kích thước lần lượt là 13,39 và 0,25 kb tương đương với kích thước của các phân đoạn pBI121/35S-pro/Mir và HSP-ter nhƣ dự kiến. Điều này chứng tỏ vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter (~13,64 kb) đã đƣợc thiết kế thành công.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pBI121/35S/Mir/HSP-ter. (A). Kết quả điện di sản phẩm cắt pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter (đường chạy 1) và pBT/HSP-ter (đường chạy 2) bằng enzym cắt giới hạn SacI và EcoRI;
(B). Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch pBI121/35S-pro/Mir mở vòng (đường chạy 1) và HSP-ter (đường chạy 2); (C). Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra pBI121/35S- pro/Mir/HSP-ter bằng enzym cắt giới hạn SacI và EcoRI (đường chạy 1); (M). Thang
DNA chuẩn DNA chuẩn 1 kb.
2,7 13,39
0,26 0,257 6
kb kb
M 1 2
10 3
0,5
5 0,25
kb kb
M 1 2
10 3
0,25
13,39
0,25
kb kb
M 1
10 3
0,25 5
A B C
0,25 5
13,39
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter
Dựa vào vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter để tạo ra vector chuyển gen tái tổ hợp pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter bằng cách thay thế promoter 35S bằng promoter E8 theo sơ đồ hình 3.8.
Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter.
Bước đầu tiên thực hiện phản ứng cắt đồng thời vector pBI121/35S- pro/Mir/HSP-ter và pBT/E8-pro bằng cặp enzym cắt giới hạn HindIII và BamHI để tạo đầu nối sole. Sản phẩm cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% thể hiện ở hình 3.9A, các phân đoạn có kích thước mong muốn pBI121/Mir/HSP-ter (~12,77 kb) và E8-pro (~2,19 kb) đƣợc thôi gel và tinh sạch theo bộ kit của Fermentas. Kết quả cho thấy các phân đoạn đảm bảo độ tinh sạch có thể sử dụng cho phản ứng ghép nối tiếp theo hình 3.9B.
Phản ứng lai ghép giữa pBI121/Mir/HSP-ter và E8-pro tiếp tục đƣợc thực hiện dưới sự xúc tác của enzym T4 ligase. Plasmid tái tổ hợp pBI121/E8- pro/Mir/HSP-ter đƣợc dòng hóa trong vi khuẩn E.coli DH5. Những dòng khuẩn lạc dương tính được sàng lọc bằng phản ứng colony-PCR sẽ được nuôi lỏng thu plamid để thực hiện phản ứng cắt kiểm tra bằng enzym giới hạn HindIII và BamHI.
Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra thể hiện ở hình 3.9C cho thấy các phân đoạn thu được có kích thước đúng như tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ vector tái tổ hợp pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter (~14,96 kb) đã đƣợc thiết kế thành công.
NOS-ter
NOS-pro NPT II (kanar) E8 Promoter MIR HSP-ter
RB LB
BamHI HindIII
Hình 3.9. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/E8- pro/Mir/HSP-ter. (A). Kết quả điện di sản phẩm cắt pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter (đường
chạy 1) và pBT/E8-pro (đường chạy 2) bằng enzym cắt giới hạn BamHI và HindIII; (B).
Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch pBI121/Mir/HSP-ter mở vòng (đường chạy 1) và E8- pro (đường chạy 2); (C). Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra pBI121/E8-pro/Mir/HSP- ter bằng enzym cắt giới hạn BamHI và HindIII (đường chạy 1); (M). Thang DNA chuẩn
DNA chuẩn 1 kb.
Cấu trúc này sau đó đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens CV58 bằng phương pháp xung điện để phục vụ cho mục đích chuyển gen vào thực vật.
3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter
Sơ đồ mô phỏng cấu trúc vector pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter đƣợc thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter.
Sử dụng enzym HindIII và BamHI để cắt các vector pBI121/35S- pro/Mir/HSP-ter và pBT/HSP-pro lần lƣợt tạo ra các phân đoạn pBI121/Mir/HSP- ter (12,77 kb) và HSP-pro (0,72 kb) quan tâm, sản phẩm điện di kiểm tra đƣợc thể
2,7 12,77
0,87 7 2,19
kb kb
M 1 2
10 3 1
2,19
kb kb
M 1 2
10 3 1
12,77 2,19
kb kb
M 1
10 3 1
A B C
12,77
NOS-ter
NOS-pro NPT II (kanar) HSP-Promoter MIR HSP-ter
RB LB
BamHI HindIII
hiện ở hình 3.11A. Các phân đoạn này đƣợc tinh sạch và điện di kiểm tra thể hiện ở hình 3.11B. Vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter (~13,49 kb) cuối cùng đƣợc tạo ra do sự ghép nối giữa hai phân đoạn pBI121/Mir/HSP-ter và HSP- pro dưới sự xúc tác của T4 ligase. Vector này tiếp tục được dòng hóa trong vi khuẩn E.coli DH5α. Các dòng khuẩn lạc dương tính được nuôi và tách plasmid để cắt kiểm tra bằng cặp enzym cắt giới hạn khác nhau (hình 3.11C). Các kết quả điện di đã cho thấy vector pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter đã đƣợc thiết kế thành công, phục vụ chuyển gen miraculin vào thực vật.
Hình 3.11. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/HSP- pro/Mir/HSP-ter. (A). Kết quả điện di sản phẩm cắt pBI121/35S/Mir/HSP-ter (đường chạy
1) và pBT/HSP-pro (đường chạy 2) bằng enzym cắt giới hạn HindIII và BamHI; (B). Kết quả điện di sản phẩm tinh pBI121/HSP-pro/Mir (đường chạy 10 và HSP-ter (đường chạy 2); (C). Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter bằng enzym cắt giới hạn HindIII và BamHI (đường chạy 1); (M). Thang DNA chuẩn DNA chuẩn 1 kb.
Vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter đƣợc biến nạp vào A.
tumefaciens CV58 và A. rhizogenes ATCC15834 để làm trung gian chuyển vào tế bào thực vật.
2,7 12,77
0,72 7 0,87
kb kb
M 1 2
10 3
1 0,72
kb kb
M 1 2
10 3 1
12,77
0,72
kb kb
M 1
10 3 1
A B C
12,77
3.2.5. Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium Vector chuyển gen đƣợc thiết kế theo mục 3.2.1, 3.2.3 và 3.2.4 sẽ đƣợc biến nạp vào A. tumefaciens CV58 và A. rhizogenes ATCC15834 bằng phương pháp xung điện. Huyền phù vi khuẩn được cấy trải trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc. Sau 2 ngày nuôi cấy ở 28oC, trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc, chọn 1 khuẩn lạc nuôi lỏng và tách plamid để thực hiện phản ứng cắt kiểm tra bằng enzym cắt giới hạn HindIII và EcoRI, kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 3.12. Theo tính toán, phân đoạn cắt ra là các cassette biểu hiện: 35S-pro/Mir/NOS, E8- pro/Mir/HSP-ter và HSP-pro/Mir/HSP-ter kích thước tương ứng 1,63 kb, 2,95 kb và 1,48 kb.
Hình 3.12. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt vector chuyển gen thu từ Agrobacterium. Từ trái qua phải: pBI121/35S-pro/Mir/NOS, pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter và pBI121/HSP-
pro/Mir/HSP-ter; (M). Thang DNA chuẩn DNA chuẩn 1 kb.
Kết quả sản phẩm cắt kiểm tra đƣợc thể hiện ở hình 3.13 cho thấy, các vector chuyển gen đã đƣợc biến nạp thành công vào các chủng Agrobacterium. Các chủng vi khuẩn này đƣợc sử dụng để làm trung gian chuyển gen vào thực vật.
10,0
2,0 1,0 kb
M 35S/Mir +
1,6 3
10,0 3,0
1,0 kb
M + E8/Mir
2,95
10,0
1,5 1,0 kb
M HSP/Mir + +
1,4 8