Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Phân lập promoter và terminator
2.2.3.1. Tách chiết và xác định độ tinh sạch DNA tổng số từ thực vật
DNA tổng số được tách từ các mẫu lá theo phương pháp CTAB (Xin, Chen 2012). Gồm các bước cơ bản: (1) Nghiền 0,5 (g) mẫu lá trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2 ml thành dạng bột mịn bằng mỏy nghiền mẫu, sau đú bổ sung 600 àl đệm chiết (phụ lục), đảo đều và ủ ở 65oC trong 2 giờ; (2) Tiếp tục bổ sung 600 àl hỗn hợp chloroform:isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều rồi ly tâm 13.000 vũng/phỳt trong 15 phỳt; (3) Hỳt 500 àl dịch nổi pha trờn sang ống
eppendorf khỏc, bổ sung thờm 500 àl isopropanol lạnh và chờ phản ứng tủa DNA ở -20oC trong khoảng 15-20 phút; (4) Ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa DNA bằng cồn 70%; (5) Loại bỏ cồn, làm khô DNA bằng máy Speed-Vac; (6) Hòa tan tủa DNA bằng nước khử ion khử trùng và bảo quản ở -20oC. Xác định độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số bằng máy Nanodrop lite (Thermo scientific, Hoa Kỳ).
2.2.3.2. Phân lập promoter và terminator bằng kỹ thuật PCR
Promoter và terminator đƣợc phân lập từ DNA tổng số thu từ lá bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu. Thành phần phản ứng gồm: master Mix 2X:
12,5àl; mồi xuụi (10 pmol): 1àl; mồi ngƣợc (10 pmol): 1 àl; DNA tổng số (50 ng/àl): 1 àl; tổng thể tớch: 25 àl. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR phõn lập promoter E8: Biến tính: 94oC/5 phút; 30 chu kỳ nhiệt: 94oC/1phút, 54oC/1 phút, 72oC/2 phút;
Hoàn thiện kéo dài chuỗi: 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng 4oC. Đối với phản ứng phân lập promoter HSP 18.2 và terminator HSP 18.2, chu kỳ nhiệt là tương tự chu kỳ nhiệt của phản ứng phân lập promoter E8, chỉ khác về thời gian gắn mồi và kéo dài chuỗi: Kéo dài: 54oC/45 giây, Kéo dài: 72oC/45 giây. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (w/v).
2.2.3.3. Nhân dòng và xác định trình tự promoter và terminator Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc tinh sạch sản phẩm PCR (theo bộ kit AccuPrep®PCR Purification Kit, Bioneer, Hàn Quốc) gồm các bước cơ bản sau: (1) Thêm Buffer PB theo tỷ lệ về thể tích giữa Buffer:sản phẩm PCR là 5:1 vào cột lọc DNA; (2) Đặt cột lọc lên ống eppendorf 2 ml, ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 30 giõy-1 phỳt; (3) Bỏ dịch phớa dưới, thờm 500 àl WB (washing buffer) vào cột lọc DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 30 giây-1 phút. Bước này nhằm loại bỏ muối và các chất hòa tan khác; (4) Bỏ dịch phía dưới, đặt cột lọc DNA trở lại ống eppendorf, bổ sung tiếp 500 àl WB, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong khoảng 30 giây-1 phút; (5) Bỏ dịch phía dưới, ly tâm làm khô ở 13.000 vòng/phút
trong khoảng 2 phút; (5) Đặt cột lọc DNA sang ống eppendorf 1,5 ml mới; (6) Thờm 30 àl nước ion khử trựng vào giữa cột lọc DNA, để khoảng 5 phỳt ở nhiệt độ phòng; (7) Ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 1 phút để thu dịch DNA tinh sạch.
Ghép nối gen vào vector tách dòng pBT
Sản phẩm PCR (promoter E8, promoter HSP 18.2 và terminator HSP 18.2) tinh sạch đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT để tạo plasmid tái tổ hợp, thành phần phản ứng gồm: sản phẩm PCR đó tinh sạch: 5àl; buffer T4 ligase (10X): 2àl; enzym T4 ligase (1 U/àl): 1àl; vector pBT (30 ng/àl): 1àl; tổng thể tớch: 10àl. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 1 giờ 30 phút. Sau đó đặt phản ứng vào đá và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt gồm cỏc bước sau: (1) Bổ sung 5 àl sản phẩm ghộp nối vào ống eppendorf đựng tế bào khả biến đã làm tan đá, trộn nhẹ, sau đó ủ trong đá 30 phút; (2) Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42oC trong 45 giây trong bể ổn nhiệt sau đó chuyển ngay vào đá, để 5 phút; (3) Bổ sung 250 àl mụi trường LB lỏng, nuụi lắc ở 200 vũng/phỳt trong 1 giờ ở 37oC; (4) Cấy trải 200 àl dịch biến nạp lờn đĩa thạch LB bổ sung carbenicilin 100 mg/l, X-gal 30 mg/l và IPTG 200 mM/l, sau đó nuôi trong khoảng 14-16 giờ ở 37oC.
Chọn dòng khuẩn lạc bằng kỹ thuật Colony-PCR
Sau nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc, thấy xuất hiện các khuẩn lạc xanh, trắng. Chọn một số khuẩn lạc trắng để tiến hành phản ứng Colony-PCR với cặp mồi M13 F/R nằm trên vector pBT để xác định khuẩn lạc có mang đoạn gen quan tâm. Thành phần phản ứng Colony-PCR tương tự thành phần phản ứng PCR, chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm Colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% để chọn ra khuẩn lạc mang gen mong muốn.
Tách chiết plasmid
Đối với các khuẩn lạc đƣợc xác định mang đoạn gen quan tâm sẽ đƣợc nuôi trong 2-5 ml LB lỏng chứa kháng sinh chọn lọc lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC.
Sử dụng Kit để tách chiết plasmid (Bioneer, Hàn Quốc): (1) Hút 2 ml dịch khuẩn cho vào ống eppendorf 2 ml, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào;
(2) Hũa tan tế bào trong 250 àl đệm chiết 1, vortex cho tan hết cặn tế bào; (3) Bổ sung 250 àl đệm chiết 2, đảo nhẹ, ủ vào đỏ 5 phỳt; (4) Bổ sung 350 àl đệm chiết 3, đảo nhẹ, ủ vào đá 5 phút; (5) Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút; (6) Hút dịch phía trên chuyển sang cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút; (7) Đổ dịch phớa dưới, bổ sung 700 àl đệm chiết 4 vào cột lọc, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phút; (8) Đổ dịch phía dưới, ly tâm bổ sung 13.000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô plasmid trên màng lọc của cột; (9) Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml mới, bổ sung 30-40 àl nước ion khử trựng, để ở nhiệt độ phũng khoảng 5 phỳt; (10) Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8%.
Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới hạn
Từ plasmid thu đƣợc, tiến hành kiểm tra sự có mặt của gen đƣợc ghép nối bằng phản ứng của enzym cắt giới hạn, thành phần gồm: plasmid tỏi tổ hợp: 5àl;
buffer Tango (10X): 1àl; enzym BamHI: 0,2àl; tổng thể tớch: 10àl. Ủ phản ứng ở 37oC trong 2 giờ, sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.2.3.4. Xác định và phân tích trình tự nucleotide
Các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn (promoter E8, promoter HSP 18.2 và terminator HSP 18.2) đƣợc xác định bằng máy giải trình tự ABI PRISM®3100 Avant Genetic Analyzer tại phòng Thí nghiệm trọng điểm và Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các trình tự được xử lý bằng các phần mềm/chương trình: BLAST/NCBI, Bioedit và cơ sở dữ liệu về promoter thực vật (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE).