Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin
Dựa trên nguyên liệu từ mục 2.2.3, thiết kế các vector chuyển gen: (1) pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter; (2) pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter; (3) pBI121/E8- pro/Mir/HSP-ter; (4) pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter.
Quá trình thiết kế vector chuyển gen này gồm các bước chính sau: (1) Tạo nguyên liệu cho phản ứng lai ghép; (2) Lai ghép các đoạn gen tạo plasmid tái tổ hợp; (3) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α; (4) Chọn dòng khuẩn lạc bằng kỹ thuật Colony-PCR và cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp; (5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng Agrobacterium bằng phương pháp xung điện.
2.2.4.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter (1) Tạo nguyên liệu cho phản ứng lai ghép
Vector chuyển gen pBI121 mang gen GUS và vector pBluescript II SK/Mir mang gen miraculin nhân tạo đƣợc cắt đồng thời bằng cặp enzym giới hạn BamHI và SacI để tạo đầu sole. Sản phẩm cắt điện di trên gel agarose 0,8% cho tới khi các phân đoạn được tách biệt ra hoàn toàn. Các phân đoạn có kích thước tương ứng với vector pBI121 đã cắt bở gen GUS và gen miraculin nhân tạo đƣợc thu nhận và tinh sạch (thôi gel) bằng bộ kit AccuPrep® Gel Purification (Bioneer, Hàn Quốc) gồm các bước cơ bản sau: (1) Cắt gel mang đoạn gen quan tâm, cân gel thu được, quy ước 1 mg tương đương 1 àl; (2) Bổ sung dịch GB theo tỷ lệ Vmẫu:VGB = 1:5 (àl); (3) Ủ ở 60oC trong 10 phút cho gel tan hoàn toàn; (4) Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột; (5) Bổ sung 500 àl GB, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, loại bỏ dịch chảy qua cột;
(6) Bổ sung 500 àl WB để rửa sạch sản phẩm, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết dung dịch WB; (8) Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml và (9) Hũa tan DNA trong 30-50 àl nước khử ion đã khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu lấy dịch.
(2) Thực hiện phản ứng lai ghép
Gen miraculin tinh sạch đƣợc lai ghép vào vector pBI121 đã cắt mở vòng dưới sự xúc tác của T4 DNA ligase để tạo thành vector tái tổ hợp pBI121/35S- pro/Mir/NOS-ter. Hỗn hợp phản ứng lai ghép đƣợc ủ ở 22oC trong 2h theo thành phần bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng lai ghép
Thứ tự Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
1 pBI121 đã cắt mở vòng bằng BamHI và SacI (100-200 ng/àl)
1-2
2 Gen miraculin cũng đƣợc cắt bằng cùng cặp enzym (100- 200 ng/àl)
2-4
3 Buffer Tango 10X 1
4 T4 ligase 1-2
5 Bổ sung nước đề ion khử trùng đến 10-20
(3) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng sốc nhiệt Tế bào khả biến E. coli DH5α lấy từ tủ -84oC đặt ngay vào đá để rã đông trong 5 phút. Cho toàn bộ sản phẩm lai ghép vào ống tế bào khả biến, trộn nhẹ và để trong đá 10 phút. Cho hỗn hợp vào bể ổn nhiệt 42oC trong 1 phút. Sau đó lấy ra để ngay trong đỏ 5-10 phỳt. Bổ sung 300 àl LB lỏng để nuụi phục hồi, hỗn hợp đƣợc nuụi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải để trải 100-200àl dịch khuẩn lên môi trường LB đặc có chứa 100 mg/l cacbercillin, X-gal 40 mg/l, IPTG 100 àM. Cuối cựng ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ.
(4) Chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp Chọn dòng khuẩn lạc bằng kỹ thuật Colony-PCR
Lựa chọn ngẫu nhiên 5-10 khuẩn lạc trên đĩa ủ sản phẩm biến nạp, mỗi khuẩn lạc đƣợc sử dụng một ít cho phản ứng colony-PCR với cặp mồi Mir_opt_F/R
theo chu kỳ 94oC/3phút; 94oC/45 giây, 54oC/30 giây, 72oC/45 giây; 72oC/10 phút, lặp lại 30 chu kì.
Chọn dòng khuẩn lạc phản ứng cắt bằng enzym giới hạn
Những khuẩn lạc dương tính trong phản ứng colony-PCR sẽ tiếp tục được kiểm tra bằng phản ứng cắt plasmid pBI12135S-pro/Mir/NOS-ter tái tổ hợp bởi enzym giới hạn BamHI và SacI theo thành phần: plasmid tỏi tổ hợp: 16 àl; buffer Tango (10X): 2 àl; enzym BamHI: 1 àl; enzym SacI: 1 àl; tổng thể tớch: 20 àl. Ủ phản ứng ở 37oC trong 2 giờ, sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
(5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào Agrobacterium bằng phương pháp xung điện Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến Agrobacterium có bước chuẩn bị tương tự mục 2.2.4.1 (4) chỉ khác là hỗn hợp gồm vector tái tổ hợp đƣợc đặt vào thiết bị để xung điện theo cỏc thụng số: 2,5 kV, 25 àF, 200 Ω.
Nhiệt độ nuôi là 28oC. Thời gian nuôi phục hồi là 1 giờ, thời gian nuôi chọn lọc là 48 giờ.
2.2.4.2. Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter
Các bước thiết kế vector pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter tương tự như mục 2.2.4.1. Vector pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter đƣợc cắt bằng cặp enzym cắt giới hạn SacI và EcoRI để cắt bỏ gen NOS-ter, thu nhận pBI121/35S/Mir. Tương tự, cặp enzym này cũng đƣợc sử dụng để cắt vector pBT/HSP-ter để thu lấy HSP-ter.
Vector tái tổ hợp đƣợc dòng hóa trong E.coli DH5α, sử dụng để thiết kế vector chuyển gen tiếp theo.
2.2.4.3. Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter
Các bước thiết kế vector pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter tương tự như mục 2.2.4.1. Sử dụng enzym cắt giới hạn HindIII và BamHI để cắt promoter 35S khỏi pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter (mục 2.2.4.2) để thu nhận pBI121/Mir/HSP-ter.
Tương tự, cặp enzym này cũng được sử dụng để cắt vector pBT/E8-pro thu lấy E8-
pro. Vector tái tổ hợp pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter đƣợc dòng hóa trong tế bào E.coli DH5 và A. tumefaciens.
2.2.4.4. Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter