3.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy
Ria tăm bông đã có bệnh phẩm vào 1 đĩa thạch máu, 1 đĩa môi trường Tellurite, 1 ống môi trường huyết thanh đông Loeffler, để tủ ấm 370C.
Trên môi trường huyết thanh đông sau 16-18 giờ trực khuẩn bạch hầu đã
mọc. Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục, đường kính độ 1-2 mm, dễ tan trong nước muối
đẳng trương.
- Chọn khuẩn lạc điển hình để làm phiến đồ, nhuộm xem hình thái và hạt nhiễm sắc.
- Sau đó cấy chuyển sang môi trường Loeffler, 1 ống canh thang não tim BHI (Brain Heart Infusion) để tiêm truyền chuột lang, làm phản ứng sinh vật hoá
học, phản ứng Elek
111
Sau 24 giờ, trên môi tr−ờng thạch máu có thể phân biệt tính chất khuẩn lạc của các týp sinh học của bạch hầu.
- Týp gravis có khuẩn lạc lớn, dẹt, màu xám, bề mặt đục mờ - Týp mitis khuẩn lạc nhỏ hơn, thẫm hơn, lồi, bề mặt bóng láng
- Týp intermedius kích th−ớc khuẩn lạc nhỏ nhất, bề mặt bóng láng hoặc xù xì.
Trên môi tr−ờng chọn lọc Tellurite, sau 48 giờ mới thấy nhiều khuẩn lạc có màu xám đen, dùng que cấy đẩy khuẩn lạc sẽ tr−ợt.
3.3.2. Kỹ thuật xác định nhanh vi khuẩn bạch hầu
Soi kinh hiển vi tìm vi khuẩn sơ bộ: dùng tăm bông đã lấy bệnh phẩm phết vào lam kính, nhuộm tìm hình thể vi khuẩn
Nuôi cấy vi khuẩn bằng tăm bông có huyết thanh:
- Lấy tăm bông ngâm vào huyết thanh ngựa vô khuẩn, làm đông huyết thanh bằng
đun cách thủy 800, 15 phút.
- Dùng tăm bông đó để lấy bệnh phẩm, rồi để vào ống nghiệm vô khuẩn ở 370C/2 giờ. Kết quả nuôi cấy đọc sau 2 giờ: thường 80% dương tính và 95% dương tinh sau 4 giê
- Dùng dung dịch kali telurit 2% bôi lên thành niêm mạc bị tổn th−ơng, nếu có trực khuẩn bạch hầu có giả mạc thì sau 5 -10 phút giả mạc trắng chuyển màu xám đen
3.3.3. Ph−ơng pháp nhuộm
*Nhuém Gram
- Nhuộm trực tiếp từ tăm bông lấy bệnh phẩm hoặc từ khuẩn lạc trên môi tr−ờng nuôi cấy. Nhuộm theo th−ờng qui của Viện Vệ sinh dich tễ TW.
- Hình thể vi khuẩn: trực khuẩn bắt mẫu tím, hơi cong có khi một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay nh− hàng rào.
*Nhuém Pugh
- Chuẩn bị tiêu bản: lấy khuẩn lạc trên môi tr−ờng Loeffler sau 18-24 giờ nuôi cấy. Để khô và cố định bằng nhiệt. Nhỏ thuốc nhuộm Pugh, chờ 2 -3 phút, rửa nước và để khô tự nhiên.
- Soi bằng kính hiển vi điện tử, vật kính dầu 100X: thấy hạt nhiễm sắc bắt mầu tím đỏ, còn các nguyên sinh chất bắt mầu xanh.
3.3.4. Xác định độc tố vi khuẩn 4.3.4.1. Tiêm truyền chuột lang:
Lấy vi khuẩn đã cấy 24 giờ trên môi trường huyết thanh đông hòa với 5 ml
112
nước đẳng trương. Tiêm 1 ml hỗn dịch vi khuẩn vào dưới da chuột lang nặng 250gam. Chuột sẽ chết trong khoảng 24-72 giờ. Nếu do vi khuẩn bạch hầu thì có những th−ơng tổn sau đây:
- Chỗ tiêm bị phù thũng - Hạch gần chỗ tiêm s−ng to
- Tuyến trên thận s−ng to và ứ máu - Đáy phổi ứ máu nhẹ.
3.3.4.2. Phản ứng trung hoà:
- In vivo: Tiêm truyền chuột lang
Chọn 2 chuột lang có cân nặng bằng nhau, mỗi con khoảng 250 gam. Đánh dấu chuột A và B.
Tiêm qua màng bụng chuột A huyết thanh kháng độc tố bạch hầu theo liều l−ợng 4 đơn vị quốc tế cho 1 gam cân nặng của chuột. Chuột B không tiêm huyết thanh kháng độc tố.
Sau 1 giờ, tiêm d−ới da cho cả 2 chuột A và B, mỗi con 1ml hỗn dịch vi khuẩn bạch hầu (đã pha theo hướng dẫn trên). Theo dõi nếu thấy sau 24-72 giờ:
chuột A không chết do đ−ợc huyết thanh kháng độc tố bảo vệ, còn chuột B chết thì
ta có thể chắc chắn là chủng bạch hầu đó sinh độc tố.
- In vitro: dùng tế bào VERO xác định kháng độc tố bạch hầu
Tế bào VERO là dòng tế bào th−ờng trực có nguồn gốc tử tế bào thận khỉ xanh châu Phi rất nhậy với độc tố bạch hầu.
Nguyên lý của ph−ơng pháp: huyết thanh thử và huyết thanh chuẩn đ−ợc pha loãng với những nồng độ khác nhau, sau đó đ−ợc ủ với 1 liều độc tố ức chế tế bào
đã được xác định trước. Tế bào VERO cho vào hỗn dịch trên được xem như chất chỉ thị: do l−ợng độc tố thừa không bị trung hoà bởi kháng thể có trong huyết thanh sẽ gây độc cho tế bào, làm chết tế bào, do vậy môi trường nuôi cấy tế bào (có mầu đỏ) sẽ không chuyển mầu. Ng−ợc lại ở mẫu huyết thanh có nồng độ kháng thể cao, độc tố bị trung hoà, tế bào vẫn phát triển bình thường, môi trường chuyển từ mầu đỏ sang vàng.
Phương pháp dùng tế bào VERO có độ nhạy là 0,005 UI/ml là phương pháp in vitro duy nhất có khả năng xác định nồng độ kháng thể trung hoà. Phương pháp này có thể thay thể phương pháp trung hoà trên chuột lang để xác định hàm lượng kháng độc tố bạch hầu.
113 3.3.4.3. Phản ứng Elek:
* Phản ứng Elek cổ điển
Trong hộp lồng đặt một miếng giấy lọc vô khuẩn 1,5 x 6cm, dùng pipét vô
khuẩn lấy kháng huyết thanh bạch hầu nhỏ vào giấy thấm 0,20 - 0,25 ml (kháng huyết thanh có nồng độ 1000 đơn vị/1ml).
Đặt vào tủ ấm 370C, hong khô trong 1-2 giờ. Sau đó đổ 1 lớp thạch Elek mỏng phủ lên các miếng giấy thấm kháng huyết thanh (chú ý thạch đun đã để nguội 40-500C), trong tr−ờng hợp nếu không có thạch Elek có thể dùng thạch th−ờng 2,5% để thay thế.
Khi môi trường đã khô hẳn, cấy các chủng vi khuẩn khả nghi theo các đường cấy thẳng góc với miếng giấy.
Mỗi hộp lồng có thể cấy đ−ợc 5-6 chủng vi khuẩn. ủ ấm 370C/48-72 giờ.
* Phản ứng Elek mới:
Đổ thạch Elek vào hộp lồng 90 mm. Dùng ống đục thạch đường kính 12 mm, tạo một lỗ ở giữa đĩa. Nhỏ kháng huyết thanh bạch hầu vào lỗ (nồng độ tương tự phản ứng cổ điển). Cấy vi khuẩn xung quanh lỗ (chia thành 6 vị trí). ủ ấm 370C/48-72 giê
Hình 2. Phản ứng Elek mới Kết quả:
- Nếu là vi khuẩn bạch hầu có độc tố sẽ gây nên hiện t−ợng kết tủa (giữa độc tố và kháng huyết thanh), tạo nên những đường trắng đục gần miếng giấy.
- Cần làm đối chứng với chủng bạch hầu gây bệnh có độc tố để so sánh.
D. khoanh giÊy