4. Phân tích và Nhận định kết quả
3.2. Quy trình xét nghiệm
Quan sát dưới kính hiển vi thường kiểm tra vi khuẩn tả di động và bị bất hoạt bằng kháng huyết thanh đặc hiệu Vibrio cholerae O1 hoặc O139.
Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào n−ớc muối sinh lý, rỏ 1 giọt lên lam kính,
đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên. Soi tiêu bản trực tiếp trên kinh hiển vi thường thấy vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi tr−êng.
Lam kính 2: rỏ 1 giọt huyền dịch phân lên lam kính, rỏ 1 giọt kháng huyết thanh tả đa giá V. cholerae 01 . Nếu là V. cholerae 01 vi khuẩn sẽ bị bất động.
Phương pháp soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi nền đen đã được sử dụng từ lâu, nh−ng không phù hợp với điều kiện của các phòng xét nghiệm tuyến tỉnh.
Trên kính hiển vi nền đen phẩy khuẩn tả di động nh− sao đổi ngôi.
3.2.2. Nhuộm gram: xem hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn tả
V. cholerae là trực khuẩn Gram âm, có hình cong nh− dấu phẩy.
Hình 1:Hình ảnh nhuộm Gram của V. cholerae (trực khuẩn gram âm)
177 3.2.3. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
3.2.3.1. Cấy trực tiếp từ mẫu phân hoặc từ ống môi tr−ờng vận chuyển Cary- Blair sang các môi tr−ờng sau đây:
- ống môi tr−ờng tăng sinh peptôn kiềm (1) / 37OC / 3 ữ 6 giờ;
- Đĩa môi tr−ờng chọn lọc TCBS (1)/ 37OC / 24 giờ;
- Đĩa môi tr−ờng thạch kiềm (1)/ 37OC / 24 giờ;
3.2.3.2. Sau 3-6 giờ cấy chuyển từ ống peptôn kiềm (1) sang ống peptôn kiềm (2),
đồng thời cấy chuyển sang đĩa môi trường TCBS và thạch kiềm (2) / 37OC / 24 giờ.
Cần thiết cấy chuyển sang ống peptôn kiềm lần 3.
N−ớc peptôn kiềm th−ờng đ−ợc sử dụng nhất, pH của canh thang này từ 8,4 - 9,2 thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. ở môi tr−ờng dinh d−ỡng, V. cholerae sống từ 6 - 8 giờ. Canh thang giàu dinh dưỡng thường được sử dụng để phục hồi vi khuẩn, nhất là khi phân thành khuôn.
Có thể dùng một số canh thang giàu chất dinh d−ỡng khác nh−: peptôn kiềm - tellurite, canh thang Monsur's tellurite-taurocholate, và canh thang sodium- gelatin phosphate.
Môi tr−ờng nuôi cấy chọn lọc th−ờng đ−ợc sử dụng phân lập V. cholerae là thạch TCBS (Thiosulphate - Citrate - Bile salts - Sucrose). Tính chất khuẩn lạc vi khuẩn tả trên môi tr−ờng TCBS: màu vàng, to và nhẵn. Trên môi tr−ờng thạch kiềm:
khuẩn lạc vi khuẩn tả tròn nhỏ, trong, −ớt, long lanh nh− hạt s−ơng. Vi khuẩn tả
mọc nhanh trên môi tr−ờng thạch kiềm (khoảng vài giờ), nh−ng chọn khuẩn lạc khó chính xác vì dễ lẫn với một số vi khuẩn khác.
(1) (2) (3)
(1) Khuẩn lạc V. cholerae trên môi tr−ờng TCBS.
(2) Khuẩn lạc V. cholerae trên môi tr−ờng thạch kiềm.
3) Khuẩn lạc trên môi tr−ờng V. parahaemolyticus trên môi tr−ờng TCBS.
Hình 2: Hình ảnh khuẩn lạc V. Choleraetrên 03 loại môi tr−ờng
178
Có thể dùng một số môi tr−ờng nuôi cấy chọn lọc khác nh−: Monsur's tellurite-taurocholate gelatin, thạch Vibrio, thạch polymyxin-mannose- tellurite.
3.2.3.3. CÊy mÉu thùc phÈm
Cân 25 gam rau hoặc thực phẩm từng loại, cắt nhỏ cho vào túi ni lông rồi
đồng nhất mẫu bằng máy.
Cho mẫu đã đồng nhất vào 225 ml môi trường tăng sinh peptôn kiềm (lần 1), cấy chuyển 3 lần/3-6 giờ môt lần.
Cấy chuyển từ môi tr−ờng peptôn kiềm (1) sang môi tr−ờng TCBS và thạch kiÒm.
Tiếp tục làm các b−ớc nh− mẫu phân.
3.2.3.4. CÊy mÉu n−íc
Lấy 900 ml nước cho vào 100 ml nước peptôn kiềm đặc gấp 10 lần (peptôn 10X) so với peptôn kiềm. Cấy chuyển sang ống peptôn kiềm 1X, cấy chuyển 3 lần/
3-6 giờ môt lần.
Tiếp tục làm các b−ớc nh− phân lập vi khuẩn từ mẫu phân.
3.2.4. Xác định tính chất sinh vật hoá học
3.2.4.1. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae từ đĩa môi trường TCBS và thạch kiềm (1) kiểm tra phản ứng oxydaza (+), cấy chuyển sang các môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học gồm 7 ống sau đây:
Kligler (song ®−êng) Arabinoza
Manit di động Mannoza
Urê Indol Saccaroza
LDC
3.2.4.2. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae từ đĩa môi trường TCBS và thạch kiềm (2) kiểm tra phản ứng oxydaza (+), cấy chuyển sang các môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học t−ơng tự nh− b−ớc 5.
Bảng 2: Tính chất sinh vật hóa học của V. cholera
Oxydaza + Indol +
Glucoza / Hơi + / + Lysin decarboxylaza (LDC) +
Lactoza / H2S - / - Arabinoza -
Manit + Mannoza -
Di động + Saccaroza +
Urê -
179 H×nh 3:
3.2.5. Xác định týp huyết thanh
Xác định vi khuẩn bằng phản ứng ng−ng kết trên lam kính với kháng huyết thanh đa giá V. cholerae 01, O139. Nếu ng−ng kết với kháng huyết thanh đa giá V.
cholerae 01, tiếp tục làm phản ứng ng−ng kết với kháng huyết thanh đơn giá Inaba và Ogawa.
Lưu ý: nên làm phản ứng ngưng kết với khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc nh−: thạch th−ờng.
3.2.6. Chẩn đoán phân biệt 3.2.6.1. Phản ứng oxydaza
V. cholerae có phản ứng oxydaza (+), đây là phản ứng quan trọng để phân biệt V. cholerae với các vi khuẩn đ−ờng ruột khác.
Cách tiến hành: Rỏ vài giọt dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride hoặc oxalate lên mảnh giấy lọc. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn đều lên giấy lọc đã thấm thuốc thử. Quan sát sự đổi màu trong vài phút.
Chứng d−ơng: Ps. aeruginosa Chứng âm: E. coli Hình 4: Hình ảnh phản ứng oxydaza
Cách đọc kết quả: Phản ứng (+): xuất hiện màu xanh tím đậm Phản ứng (-): không xuất hiện màu xanh tím đậm
180
# Lưu ý: không nên lấy khuẩn lạc trực tiếp từ thạch TCBS làm phản ứng oxydaza có thể cho kết quả sai. Nên cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ từ môi truờng TCBS sang môi tr−ờng không chọn lọc nh− thạch th−ờng hoặc thạch máu rồi làm phản ứng oxydaza.
3.2.6.2. Phân biệt với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G Heiberg chia phẩy khuẩn thành 6 nhóm:
Bảng 3. Sơ đồ phân chia nhóm phẩy khuẩn
Nhãm Mannoza Saccaroza Arabinoza
I + + -
II - + -
III + + +
IV - + +
V + - -
VI - - -
Vi khuẩn V. cholerae 01 gây bệnh tả thuộc nhóm I, từ nhóm II đến nhóm VI thuộc các phẩy khuẩn nhóm N.A.G.
3.2.6.3. Phân biệt với V. parahaemolyticus
Bảng 4: sơ đồ phân biệt V. cholerae với V. parahaemolyticus
V. cholerae N.A.G V. parahaemolyticus
Saccaroza + + -
Arabinoza - - +/ -
Mannoza - +/ - +
0%NaCl + + -
3%NaCl + + +
10%NaCl - - -