3.1. Chuẩn bị dụng cụ, môi tr−ờng, hóa chất
3.1.1. Dụng cụ cần thiết (chủ yếu)
- Máy vortex, ly tâm - Máy đo pH
- Giàn máy ELISA: máy ủ, máy lắc bản, máy rửa, máy đọc - Giàn máy PCR
- Bản nhựa 96 giếng, hãng NUNC, Đan mạch - Pipét vi l−ợng các loại
- Hộp lồng đ−ờng kính 90mm - Tủ ấm 370C, tủ lạnh, tủ âm 200C.
- Dung dịch tiệt trùng vật liệu thải - Ph−ơng tiện bảo hộ cá nhân
- Phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức độ 3 hoặc tương đương 3.1.2. Môi tr−ờng hóa chất, sinh phẩm
3.1.2.1. Thuèc nhuém:
Công thức thuốc nhuộm Wayson:
Xanh methylen 0,75g
Fuchsin kiÒm 0,2 g
Cồn tuyệt đối 20 ml
Phenol 5% 200 ml
Hòa tan 0,75 g xanh methylen trong 10 ml cồn tuyệt đối và 0,2 g fuchsin kiềm trong 10 ml cồn tuyệt đối. Sau đó pha lẫn hai dung dịch mầu rồi cho thêm 200 ml dung đỏ phenol 5% (pha trong nước cất). Sau 24 giờ đun, lọc, dùng để nhuộm.
3.1.2.2. Môi tr−ờng nuôi cấy
- Canh thang Hottinger, BHI (theo hãng sản xuất)
- Thạch peptone, MacConkey, thạch mềm (theo h−ớng dẫn của nhà sản xuất) - Thạch Natri Sulfit
Thạch th−ờng pH = 7,4 100ml
Dung dịch natri sulfit 10% 0,25ml Dung dịch tím gentian 1‰ 2 - 4ml Máu cừu hoặc huyết thanh 2ml
153
Cho các dung dịch hóa chất vào bình thạch đun cho tan hết. Để nguội 45- 500C, cho them máu cừu hoặc huyết thanh lắc đều tránh nổi bọt, đổ ra đĩa hoặc
đóng ống nghiệm.
3.1.3. Môi tr−ờng thử tính chất sinh vật hóa học:
- Glyxerin, indol, ramnose, urea, H2S
3.1.4. Các dung dịch đệm cho phản ứng ELISA
Đệm PBS (10X) pH = 7,4:
NaCl 80g
KH2PO4 2g
Na2HPO4 11g
Hoặc
Na2HPO4 2H2O 13g
Na2HPO4 12 H2O 28 g
KCl 2g
N−íc cÊt 2 lÇn 1000ml
Dung dịch rửa (PBS - Tween)
Dung dịch đệm PBS (10X) 1000 ml
Tween 20 0,5 ml
Dung dịch pha loãng (PBS - Tween 20 - S#a)
Dung dịch PBS - Tween 500 ml
Sữa tách bơ 25 g
Dung dịch đệm cacbonat pH 9,6
Na2C03 1,59 g
NaHCO3 2,93g
N−íc cÊt 2 lÇn 1000 ml
Đệm citrat pH = 5,5
Citrate trisodique 29g
Acide citrique 4,1 g
N−íc cÊt 1000 ml
Dung dịch cơ chất OPD (Ortho-phenylenciamine)
Dung dịch đệm citrate 25 ml
OPD 12 mg
H202 30% 30 ml
154
Chú ý dung dịch này pha xong phải dùng ngay, đệm citrat cần để ở nhiệt độ phòng trước khi dùng để pha, dung dịch H202 cần giữ trong týp kín, tránh ánh sáng.
Dung dịch dừng phản ứng: H2SO4 2N
Cách pha: cho từ từ 2,8 ml H2SO4 nguyên chất vào trong 50 ml n−ớc cất Chú ý: H2SO4 là axít có tính ăn mòn mạnh, gây bỏng nặng, do vậy tránh tiếp xúc trực tiếp với da và niêm mạc.
3.2. Sơ đồ chẩn đoán
Đờm, máu, dịch ở hạch
Ngày 1
Nuôi cấy ở 280C và 370C/24 giờ Tách chiết ADN a. Thạch máu cừu 5%
b. Thạch MacConkey
c. Thạch não tim Xác định bằng phương pháp SHPT
a. PCR đơn mồi/đa mồi
b. real-time PCR Nhuém Giemsa
Xác định lần 1 Ngày 2-4 Chọn 1 khuẩn lạc
Thử nghiệm SVHH lần 1 X/định bằng phương pháp SHPT
a. oxidase a. PCR đơn mồi/đa mồi
b. Môi tr−ờng TSI/ 37oC b.real-time PCR
c. Môi tr−ờng LIM/ 37oC
d. Nuôi cấy trong canh thang BHI /37oC Xác định lần 2 e. Môi tr−ờng Urê/ 37oC
f. API20E
Nhuém Giemsa
Ngày 5-6
Thử nghiệm SVHH lần 2 a. §−êng sucrose/37 oC b. mellibiose /28 oC c.rhamnose/ 37 oC
Kết luận cuối cùng để chẩn đoán xác định Sơ đồ 2: Qui trình chẩn đoán Y. pestis trong phòng thí nghiệm
155 Yêu cầu:
Phòng xét nghiệm vi khuẩn dịch hạch cần riêng biệt, đảm bảo yêu cầu về an toàn sinh học theo qui định của thế giới:
- Nhân viên làm việc phải mặc quần áo, đeo găng để bảo vệ nhiễm khuẩn và đề phòng bọ chét chui vào ng−ời.
- Các mẫu bệnh phẩm phải đ−ợc sử lý trong tủ an toàn sinh học. Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn phải thực hiện tại phòng an toàn sinh học mức độ 3.
- Tuyệt đối tôn trọng quy trình vô khuẩn, sát khuẩn. Tuân thủ và thực hiện đúng thao tác kỹ thuật.
- Chuột chết, bệnh phẩm và các dụng cụ sau thí nghiệm phải đ−ợc sấy −ớt 1200C/1 giờ hoặc sử lý bằng NaClO 1000ppm, phenol 5% tr−ớc khi thải bỏ.
3.3. Các kỹ thuật
3.3.1. Nhuộm soi hình thái vi khuẩn:
Từ mẫu xét nghiệm làm phiến đồ trên lam kính, nhuộm Wayson, có khoảng trống ở giữa rỗng không bắt mầu. Có thể tìm thấy vi khuẩn ở ngoài và ở trong bạch cầu, vi khuẩn ở trong bạch cầu có nhiều giá trị chẩn đoán hơn.
* Kü thuËt nhuém Wayson:
Nhỏ vài giọt cồn 900 lên phiến đồ đã khô, để cồn bốc hơi nhẹ nhàng, phơi khô, soi dưới kính hiển vi. Y. pestis bắt màu xanh trên nền hồng hoặc đỏ.
Công thức nhuộm Wayson:
Xanh methylen 0.75 g
Fuchsin kiÒm 0.2 g
Cồn tuyệt đối 20 ml
Phenol 5% 200 ml
Hoà tan 0.75 g xanh methylen trong 10 ml cồn tuyệt đối và 0.2 g Fuchsin kiềm trong 10 ml cồn tuyệt đối. Sau đó pha lẫn cả hai dung dịch màu rồi cho thêm 200 ml dung dịch phenol 5% (pha trong n−ớc cất). Sau 24 giờ: đun, lọc, dùng để nhuộm.
* Nếu không có thuốc nhuộm Wayson có thể nhuộm gram hoặc giemsa.
156
Hình 1. Y. pestis trên tiêu bản nhuộm Giemsa độ phóng đại 1000 lần 3.3.2. Nuôi cấy
Y. pestis mọc tốt ở 280C, vừa −a khí vừa yếm khí, mọc dễ trên các môi tr−ờng thông th−ờng nh−: pepton, thạch Martin, thạch MacConkey, canh thang não tim (Brain Heart Infusion - BHI) ...
Cấy phủ tạng, bệnh phẩm, dịch nghiền bọ chét vào các môi tr−ờng phân lập sau ®©y:
- Trên môi tr−ờng thạch sulfit Natri, vi khuẩn mọc chậm, khuẩn lạc ban đầu rất nhỏ, tròng, trong, sau đó có núm lồi ở giữa, gồ ghề.
- Trên môi trường thạch Desoxycholate, sau 48 giờ ở nhiệt độ 280C, khuẩn lạc mọc rất nhỏ, th−ờng hay liên kết nhau thành từng vết mờ, màu hồng nhạt, có chu vi ngoằn ngoèo, giữa có màu đỏ sẫm.
- Trên môi tr−ờng thạch MacConkey, khuẩn lạc nhỏ, không lên men đ−ờng lactose.
- Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ ở nhiệt độ 37oC, khuẩn lạc rất nhỏ, tròn, bóng, −ớt, trong, bề mặt đầy.
Sau 48-72 giờ khuẩn lạc lớn hơn, có màu xám, bề mặt lồi lõm không đều (hình trứng rán), có thể có hiện t−ợng tan máu.
Hình 2. Y. pestis trên môi tr−ờng thạch máu sau 24 giờ
157
- Trên canh thang Hottinger: sau 48 giờ, vi khuẩn lắng xuống đáy ống, một số ít
đóng thành một lớp váng mỏng trên mặt nước canh thang, khẽ chạm sẽ rơi xuống đáy ống, môi trường trở nên trong, lắc nhẹ vẩn khói cuộn lên từ đáy ống,
đây là tính chất đặc trưng của vi khuẩn dịch hạch mọc trong môi trường lỏng.
Tính chất hoá sinh:
- Không di động
- Lên men không sinh hơi các loại đ−ờng: lactose, sacarose, ramnose - Ure - Indol: ©m tÝnh (-)
- Đỏ metyl, nitrat: d−ơng tính (+)
- Glyxerin âm (-) hoặc d−ơng (+) tuỳ theo gốc vi khuẩn dịch hạch Chẩn đoán phân biệt với các loài Yesinia khác dựa vào bảng sau:
Bảng 1: Các tính chất sinh vật hoá học của Y.pestis
Tính chất hoá sinh Y.pestis P.pseudotub P.multocida
Ramnose - + -
Glyxerin - + +
Ure - + -
§á metyl + + -
Indol - - +
H2S - + +
Di động - + 220C
- 370C -
Phagiơ + 280C
+ 370C - 280C
+ 370C -
3.3.3. Tác dụng của phagiơ
Có ba ph−ơng pháp làm dung giải vi khuẩn dịch hạch:
- Ph−ơng pháp lắng canh khuẩn - Ph−ơng pháp cấy khuẩn lạc - Ph−ơng pháp cải tiến
3.3.3.1. Ph−ơng pháp lắng canh khuẩn:
- Láng 1 ml canh khuẩn dịch hạch đã nuôi cấy 12 giờ trên một đĩa thạch Hottinger, hút hết phần n−ớc còn lại.
Phơi khô đĩa thạch 37oC/10 phút.
Nhỏ lên mặt thạch 1 giọt phage, ủ 280C/24 giờ.
Kết quả:
- D−ơng tính khi vòng vô khuẩn xuất hiện tại nơi nhỏ giọt phagiơ
- Âm tính khi không có vòng vô khuẩn
158 3.3.3.2. Ph−ơng pháp cấy khuẩn lạc:
- Cấy khuẩn lạc trên thạch Hottinger, rộng khoảng 2cm. Nhỏ vào giữa chỗ vừa cấy vi khuẩn 1 giọt phage, ủ 28oC/ 8-10 giờ.
- Kết quả d−ơng tính khi vòng vô khuẩn xuất hiện tại nơi nhỏ giọt phagiơ
3.3.3.3. Ph−ơng pháp cải tiến:
- Nhỏ 1 giọt phagiơ lên đĩa thạch máu cừu 5% + Violet gentian - Sulfit Natri đã
nuôi cấy bệnh phẩm, ủ 28oC/8 giờ.
- Kết quả (+) khi vòng vô khuẩn xuất hiện tại nơi nhỏ phagiơ.
3.3.4. Tiêm truyền súc vật
- Chuột lang, chuột bạch dễ cảm nhiễm nhất. Tiêm 0.5 ml dịch nghiền vào d−ới da 2 chuột bạch nặng 18-20 gam. Th−ờng chuột chết sau 3-5 ngày. Theo dõi 10 ngày, nếu chuột không chết thì bỏ đi.
- Chuột lang 300 gam, tiêm d−ới da 1.5 - 2ml, theo dõi nh− trên. Mổ chuột chết thấy: nơi tiêm phù thũng, hạch quanh nơi tiêm s−ng to, gan ứ máu, lách s−ng bầm tím có nhiều nốt mủ trắng hoặc xám. Trong gan, lách có rất nhiều vi khuẩn dịch hạch. Làm tiêu bản, nhuộm soi thấy vi khuẩn điển hình, cấy phủ tạng trên môi tr−ờng.
- Xát da chuột lang: khi phủ tạng của người hay chuột đã thối rữa, bệnh phẩm là, cạo lông chuột lang ở sườn, cào xước da cho rớm máu rồi xát bệnh phẩm đờm hoặc nhầy họng vào đó. Chuột sẽ chết với thương tổn giống như tiêm truyền.