3.1. Kỹ thuật xác định kháng nguyên/vi khuẩn trực tiếp
3.1.4. Ph−ơng pháp Miễn dịch gắn men (ELISA)
Nguyên tắc: Sử dụng kháng thể đặc hiệu để xác định kháng nguyên – tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy sớm hoặc trực tiếp trong bệnh phẩm bệnh nhân. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể sẽ đ−ợc nhận biết bởi cộng hợp kháng huyết thanh t−ơng ứng gắn với enzyme peroxidaza hoặc phosphataza,.. gây chuyển mầu cơ chất phù hợp. Kết quả phản ứng đ−ợc đo bằng thiết bị đo quang phổ.
Đây là phương pháp khá đơn giản, có thể thực hiện cùng một lúc nhiều bệnh phẩm, đọc kết quả dễ dàng hơn so với soi kính hiển vi, giới hạn cho phép đạt 104 tế bào vi khuẩn/ml bệnh phẩm.
Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp: 91% và 100%.
Nguyên vật liệu cơ bản:
- Máy đọc ELISA có bước sóng 450nm
- Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng (của hãng NUNC, Denmark ) - Pipetman loại 20, 200, 1000 microlit và đầu côn t−ơng ứng
- Bệnh phẩm (đờm đã hoá lỏng lấy cặn, nước tiểu, dịch rửa phế quản phế nang,v.v. hoặc hỗn dịch vi khuẩn trong nuôi cấy sớm)
- Dung dịch đệm gắn bản: PBS, pH=7,2
Thành phần của PBS: - Na2HPO4 12 H2O = 1,72gr Hoặc Na2HPO4 2 H2O = 0,85gr - KH2PO4 = 0,254 gr - NaCl = 8,5gr
- N−íc cÊt 2 lÇn = 1000 ml - Dung dịch đệm rửa bản: PBS -Tween 0,05 % ( PBS-T), pH= 7,2
- Dung dịch cơ chất TMB (Tetramethyl benzidine) (TMB:6 mg; Cồn Ethanol 700: 5ml; đệm citrat buffer pH 5: 5ml; H2O2: 5àl
- Cộng hợp kháng thể dê kháng IgG thỏ gắn men peroxidaza (Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp)
- Kháng huyết thanh thỏ kháng M.tuberculosis (Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp) - Kháng thể đơn clôn kháng đặc hiệu M.tuberculosis hoặc kháng
Lipoarabinomannan (LAM)
133 - Dung dịch dừng phản ứng: H2SO4 1N
Quy trình thực hiện ELISA
- Phủ bản với bệnh phẩm đã xử lý và bất hoạt hoặc với hỗn dịch vi khuẩn trong nuôi cấy sớm (đã bất hoạt) ở nhiệt độ 370C qua đêm không đậy nắp hoặc để khô ở nhiệt độ 58-600C
- Phong bế chỗ trống bằng 100àl dung dịch PBS-BSA 1%, ủ ở 370C x 1h
- ủ với 50àl kháng thể đơn clôn kháng đặc hiệu M.tuberculosis hoặc các Mycobacterium khác cần phát hiện.
- Rửa bản với dung dịch đệm PBS-T 0,05% 3 -5 lần
- ủ với 50àl cộng hợp kháng IgG chuột gắn peroxidaza (pha loãng 1:1000 lần với PBS-BSA1% ở 370C trong 1 giờ
- Ủ với 100àl cơ chất TMC trong 30-60 phút ở nhiệt độ phòng (trong bóng tối) - Đọc kết quả ở b−ớc sóng 405nm và ghi nhận kết quả: so sánh với kết quả phản
ứng của các chủng chuẩn để ghi nhận kết quả.
3.1.5. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biết và sao chép để khuyếch đại về mặt số l−ợng đoạn trình tự đặc hiệu trên genom của vi khuẩn. Đối với M.tuberculosis, kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 249 đôi bazơ nằm trên đoạn IS 6110, là trình tự gắn (IS-insert sequence) đặc hiệu và có khả năng tự sao chép với số l−ợng lớn (1-25 lần) trong genome vi khuÈn thuéc nhãm M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.microti, M.bovis và M.africanum).
Quá trình sao chép đ−ợc thực hiện trong một chu trình nhiệt lặp lại với sự tham gia của enzyme chịu nhiệu Taq polymerase có bản chất là ADN polymeraza, các deoxynucleotide triphosphat tự do (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và cặp đoạn mồi
đặc hiệu cho đoạn trình tự định sao chép.
Sản phẩm PCR đ−ợc phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gen agarosa hoặc các kỹ thuật lai ghép miễn dịch khác nh− lai ghép Dot plot (dot blot hybridzation), lai ghép Southern blot hoặc lai ghép với cơ chất trên phiến nhựa, v.v.
Nguyên lý của PCR: là kỹ thuật khuyếch đại số l−ợng ADN dựa trên trình tự ADN khuôn mẫu với quy trình tiến hành gồm 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi và tổng hợp kéo dài với sự trợ giúp của ADN polymerase chịu nhiệt, primers và deoxy- nucleotide triphosphates (dNTPs)
134
Giới hạn phát hiện của ph−ơng pháp là 1-3 vi khuẩn/ 1ml bệnh phẩm hoặc 10-12g ADN/ml, do vậy có vai trò quan trọng trong chẩn đoán các thể lao AFB âm tính hoặc lao ngoài phổi, khó chẩn đoán bằng các ph−ơng pháp thông th−ờng.
Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR trong chẩn đoán bệnh lao: 50-80% và 90-100%
Hoá chất, dung dịch cần thiết cho PCR chẩn đoán Lao
Dung dịch TTE: 1% Triton X 100 pha trong 20mM Tris-HCl pH=8,3 + 1mM EDTA (bảo quản trong đông lạnh); Hấp −ớt khử trùng 1210C x 15 phút
Dung dịch TE: 10 mM Tris HCl + 1mM EDTA, pH 8,3; Hấp −ớt khử trùng 1200C x 20 phót
Dung dịch xử lý đờm:
Dung dịch 1 ( NaOH 1M): 40 gr NaOH / 1 lít H2O
Dung dịch 2 (Na-citrate 0,1M): 29,4gr Na-citrate.2H2O/lit,
Dung dịch 3 (N-acetyl-L-cysteine-NALC): 15 mg trong 3ml dd 1+ dd 2 Hấp −ớt khử trùng 1200C x 20phút đối với dung dịch 1 và 2
Dung dịch proteinase K: 5% Triton X-100, 1mg proteinase K hoà trong 1ml 20 mM Tris-HCl pH 8,3 + 1mM EDTA
Dung dịch phá vỡ tế bào và tách ADN:
Dung dịch L6: 120 gr Guaniginum thiocyanate GuSCN (Fluka, Thuỵ sỹ) pha trong 100ml 0,1M Tris HCl, pH 6,4 + 22ml EDTA 0,2M và 2,6ml Triton X-100;
hấp −ớt khử trùng 1200Cx20 phút
Dung dịch rửa L2: 10gr GuSCN /100ml Tris HCl 0,1M, pH 6,4; hấp −ớt khử trùng 1200Cx20 phút
Hỗn dịch Diatom (celite): 10gr pha trong 50ml H2O + 500àl HCl 32% (hoặc 445àl HCl 36%)
Dung dịch chạy điện di
Dung dịch đệm TBE đặc 10X, pH=8,3:
- 0,89M Tris 108g - 0,89M boric axit 55g
- 0,02M EDTA 40ml (0,5M EDTA pH8,0) - H2O 1 lÝt
Đệm chạy mẫu (loading buffer): 100% glycerol: 50ml TE 10X 50ml Bromophenol blue 0,015g
Quy trình thực hiện PCR:
* Pha hỗn dịch Mix (thực hiện tại phòng chuẩn bị Mix)
135
Để pha chế hỗn dịch mix, tính số l−ợng mẫu cần xét nghiệm và tính toán lượng Mix cần thiết với các thành phần tương ứng. Dưới đây là ví dụ cách tính để pha đủ cho 50 ống PCR với l−ợng 50àl mix/ống.
Bảng 1: Các thành phần sinh phẩm trong phản ứng PCR
Thành phần Trình tự
cho vào
Số l−ợng (àl) cho một ống (tổng: 50àl)
Nồng độ cuối cùng N−íc cÊt 2 lÇn Milli Q
Đệm phản ứng (10x) Gelatin 0,1% (w/v) MgCl2 25mM dNTP (hỗn hợp)
- dATP 20mM - dCTP 20mM - dGTP 20mM - dUTP 20mM Mồi: 50àM 330àg/ml Ampli Taq polymerasa
Uracil-ADN-glycosylase (UDG) 1U/àl
Bệnh phẩm, ADN hoặc TE
(a) (b) (c) (d) (e)
(g) (h) (i) (k)
L−ợng cần thiết 5
5
4 hoặc 6 0,5
0,2 0,2 0,2 5-15
10mM TrisHCl 0,01%
2-3 mM 0,2 mM/loại
0,2 àM 1U/50àl 0,2/èng 5-15àl/ống
*. Xử lý bệnh phẩm B−íc 1.
- Dịch: Ly tâm lấy cặn trong ống Eppendorf, 12000 v/ phút x10 phút
- Đờm: Khử nhiễm bằng 1 thể tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + 1 thể tích Natri Citrat 0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC) (15mg/100ml), lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm tách cặn nh− đối với dịch
- Mảnh sinh thiết và mủ: Ly giải bằng Protease K qua đêm ở 560C
B−ớc 2. Xử lý bệnh phẩm có máu bằng TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris- HCl pH 8.3, 1m EDTA): cho 1ml dung dịch TTE vào mẫu đã tách cặn, lắc kỹ cho tan máu, ly tâm loại bỏ n−ớc nổi.
B−ớc 3. Bất hoạt 100OC trong 10 phút
* Tách ADN của vi khuẩn trong bệnh phẩm (Ph−ơng pháp BOOM) B−ớc 1. Phá tế bào giải phóng ADN
Cho 0,9ml dung dịch ly giải tế bào L6 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris- HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH 8.0 và 2.6 ml Triton X 100) và 20àl diatom 20%
vào mỗi bệnh phẩm. Lắc kỹ bằng máy lắc trong ít nhất 10phút. Ly tâm, lấy cặn.
136 B−ớc 2. Tinh sạch ADN
Rửa 2 lần bằng dung dịch L2 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4) Rửa 2 lần bằng Ethanol 70%
Rửa 1 lần bằng acetone
Phơi khô trong bể n−ớc 560C (10-15 phút ) B−ớc 3. Thu hồi ADN
Cho 70àl TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) vào mỗi mẫu, ủ 56 0 C, 10 phút. Lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng / 2 phút. Tách n−ớc nổi chứa ADN và sử dụng
để chạy PCR
* Cho mẫu vào ống phản ứng PCR
Dung dịch chứa ADN sau khi đ−ợc tách từ bệnh phẩm đ−ợc cho vào ống phản ứng đã chứa sẵn 35àl hỗn dịch mix. Mỗi bệnh phẩm cần có hai ống phản ứng (ống a và ống b). Ống a sử dụng để chạy phản ứng với bệnh phẩm, ống b dùng để kiểm tra chất ức chế nếu có trong bệnh phẩm. ống b ngoài ADN tách từ bệnh phẩm còn đ−ợc cho thêm ADN của M.smegmatis đã đ−ợc biến đổi bằng gắn thêm một
đoạn trình tự IS6110. Cặp mồi Pt18 và INS2 có khả năng khuyếch đại trình tự 249
đôi bazỏ trên IS6110 của M. tuberculosis, và khuyếch đại cả trình tự 305 đôi bazơ
trên IS6110 của M. smegmatis.
- ống a: 10àl d2 ADN đã tách từ bệnh phẩm
- ống b: 5àl d2 ADN đã tách từ bệnh phẩm + 5àl d2 ADN M. smegmatis 10-11g/ml - ống chứng d−ơng: 10àl ADN của M. tuberculosis 10-12g/ml (hay 10 femtogram
trong một ống phản ứng t−ơng đ−ơng l−ợng ADN tách từ 2-3 vi khuẩn) - ống chứng âm: 10àl d2 TE
*. Ch−ơng trình chạy PCR 10 phút ở 40OC 1,5 phót 94OC
2 phót 65OC x 40 chu kú 3 phót 72OC
72OC trong 1 giê
* Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đ−ợc điện di trên gel agarose 2% (2gr agarose/100ml đệm TBE pH 8,3 với 0,89M Tris, 0,89M axit boric và 0,02 EDTA): 20àl/giếng, ở hiệu
điện thế 110V, dòng điện 40mA, từ 30 đến 45 phút. Gel đ−ợc lấy ra và nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 0.2àg/ml (20 phút).
137
* Chụp ảnh và đọc kết quả
Soi gel dưới đèn UV, chụp ảnh bằng phim Polaroid
Phân tích kết quả: Bệnh phẩm có kết quả PCR d−ơng tính nếu cả 2 ống phản ứng a và b cùng dương tính, ống thứ nhất cho vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài phân tử là 249 đôi bazơ và ống thứ hai cho vạch đặc hiệu ứng với các phân tử có
độ dài 305 đôi bazơ, PCR cho kết quả âm tính nếu ống thứ nhất âm tính (không có vạch) và ống thứ hai d−ơng tính, nếu cả hai ống cùng cho kết quả âm tính thì bệnh phẩm có chất ức chế phản ứng (hình 1).
Chứng dương cho phép đảm bảo độ nhạy của hỗn dịch phản ứng có thể xác
định đ−ợc ở nồng độ 10fg ADN của M. tuberculosis trong một ống phản ứng.
Kết quả cũng có thể đọc bằng các phương pháp khác như lai ghép Dot-blot với probe đánh dấu bằng chất phóng xạ hoặc với hệ thống biotin.